巴勒斯坦西岸地区血液透析患者乙肝病毒的血清分子标志物与基因多样性研究：揭示隐匿性感染及D基因型优势

本研究报告了巴勒斯坦杰宁地区血液透析（HD）患者中乙肝病毒（HBV）的血清学及分子流行特征，重点揭示了3.75%的总体感染率（包括1.9%显性感染和1.9%隐匿性感染（OBI）），并通过对全基因组（WGS）及S区测序分析，首次在当地人群中鉴定出HBV基因型D（亚型D1与D3）的主导分布。研究强调了在免疫受损的HD人群中OBI的潜在传播风险及现有疫苗保护力（抗-HBs ≥10 IU/mL者仅45%）不足的现状，为优化区域HBV防控策略提供了关键分子流行病学依据。

　　

1. 引言

尽管有效疫苗已广泛应用，乙肝病毒（HBV）感染仍是全球重大健康负担，为病毒性肝炎的主要致病因素。2015年，全球病毒性肝炎导致约134万人死亡，其中60%由HBV相关并发症引起。HBV与39%的肝癌死亡及29%的肝硬化相关死亡有关。全球一般人群中的HBV感染流行率约3.5%，相当于超过2.5亿慢性感染者。HBV是一种包膜病毒，具有部分双链松弛环状DNA基因组，长度约3200核苷酸，属于嗜肝DNA病毒科。传统上，HBV根据全基因组≥8%或S基因≥4%的核苷酸差异划分为10种基因型（A-J）。近期系统发育分析进一步细化出24种亚型，包括A1-A3、B1-B5、C1-C6、D1-D6及F1-F4。194个WHO成员国认可的全球公共卫生战略目标是以2015年为基线，至203年将肝炎相关死亡率降低65%、新感染减少90%，该战略强调综合服务，如疫苗接种（特别是HBV疫苗）、筛查、抗病毒治疗及慢性感染长期护理。然而，HBV流行率仍居高不下，尤其在血液透析（HD）患者等高危人群中。隐匿性乙肝病毒感染（OBI）——即HBsAg阴性但HBV DNA阳性——进一步增加了消除工作的复杂性。近期系统综述显示，HD患者中HBV总体流行率为7.32%，存在地域差异：南美洲最高（9.37%），其次为大洋洲（8.45%）、亚洲（7.44%）、欧洲（7.07%）、非洲（5.52%）和北美洲（4.32%）。HD患者中HBV高流行主要归因于污染透析设备的直接传播及医护人员间接传播。透析操作中反复血管通路及与血液、医疗器具的密切接触增加了HBV传播风险，尤其在感染控制措施不足的场合。多项研究表明，终末期肾病（ESRD）患者因免疫功能受损，对HBV疫苗的免疫原性反应欠佳，这使其即便完成标准接种后仍面临较高感染风险，因此需加强预防策略及调整免疫方案。OBI作为潜在传播源，在透析等高风险环境中尤为棘手，因其低或波动病毒载量可能规避常规筛查，且与慢性肝病进展（如肝硬化、肝癌）相关，具有重要临床及公共卫生意义。本研究旨在调查巴勒斯坦西岸杰宁政府医院HD患者中HBV血清学及分子标志物流行率，并通过全基因组测序表征分离株的遗传多样性及基因/亚型。

2. 材料与方法

这项横断面研究纳入160名HD患者，于2023年1月至12月期间从杰宁政府医院HD单元随机选取。通过结构化问卷收集人口学信息及临床史，并查阅医疗记录。研究获巴勒斯坦卫生部批准（参考号：162/1481/2022），授权使用匿名临床样本及患者数据。依据研究低风险性质及数据完全匿名化，获取了口头知情同意。

2.1. 血液样本

透析前，获取HD人员常规检查采集的血液样本剩余部分，分装两管：一管用于血清学检测HBV标志物（HBsAg、抗-HBc、抗-HBs），另一管用于分子分析（DNA提取、PCR扩增及测序）。

2.2. 血清学检测

采用商业免疫酶法检测每位患者血清中的HBV标志物，包括“HBsAg”（one Version ULTRA, REF: SAG ULTR. CE）、乙肝核心抗体总“抗-HBc”（HBcAb, REF: BCAB. CE）及“抗-HBs”（REF: SAB.CE）。同时检测丙肝病毒（HCV）抗体（HCV Ab kit, REF: CVAB.CE.96）。所有试剂盒购自Dia-Pro Diagnostic Bioprobes Srl（意大利），报告灵敏度及特异性均为100%。

2.3. DNA分子检测

2.3.1. DNA提取

使用QIAamp Viral DNA/RNA Extraction Kit（Qiagen, Germany）从200μL血清中提取病毒DNA。

2.3.2. PCR

采用巢式PCR扩增HBV-DNA，靶向病毒聚合酶基因，引物参照Selabe等描述。第二轮PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳分析，647bp条带为阳性。每轮PCR设阴性（无核酸酶水）及阳性对照。

2.3.3. 病毒全基因组扩增与DNA文库制备

研究结合既往引物及新设计引物（表1）扩增HBV全基因组。新引物设计源于先前两研究引物映射至HBV基因组（NCBI参考序列JN664911）后，为提升PCR灵敏度而缩短靶标长度。基于片段大小及条带强度（支持图1），最佳扩增产物分两池混合（池1：Sets 1、3、5、7；池2：Sets 2、4、6）进行多重PCR，合并纯化（1X AMPureXP beads, Beckman Coulter）并定量（Qubit Fluorometer DNA assay, Thermo Fisher）。使用Illumina DNA Prep Kit制备DNA文库，经NextSeq 500/550 Mid Output Kit v2.5（150 Cycles）在NextSeq 500机器（Illumina）上测序。

2.3.4. 病毒全基因组组装

NextSeq 500输出的BCL文件经bcl2fastq v2.20.0.422转换为FASTQ格式。FASTQ文件通过Galaxy程序（Version 0.7.17.1）分析，使用BWA-MEM比对中长读长（>100bp）至HBV（ayw株）参考基因组（NC_003977.2）。比对结果经本地IGV可视化，从中提取一致序列作为各样本序列。IGV结果经Geneious 8.0.5确认。HBV基因分型/亚分型采用NCBI基因分型工具完成。

2.4. 统计分析

HBV感染与人口学及实验室参数关联度通过比值比（OR）、Fisher精确检验（p<0.05）评估（使用EpiInfo软件）。采用MEGA-X软件构建最大似然（ML）系统发育树（1000次bootstrap），基于全基因组（WGS, 2989nt）及S区（835nt）。系统发育树经iTOL编辑。基于中接法（median-joining）的单核苷酸变异（SNV）单倍型网络通过PopART 1.7构建（输入文件为DnaSP Version 6.12.03生成的Nexus文件）。单倍型网络按HBV DNA序列来源国着色。遗传多样性指标、群体分化及中性检验通过DnaSP Ver. 6.12.03计算（输入文件为MEGA-X生成的meg文件）。

3. 结果

3.1. 研究人群特征

HD患者中HBV总流行率为3.75%（6/160），其中1.9%（3例）为显性感染（HBsAg阳性），1.9%（3例）为OBI。所有感染者均为男性，但p值（0.03）及OR（11.87）因95%CI包含1.0（0.65–214.3）而无显著意义。HCV阳性率为1.9%（3/160），在HBV患者中显著较低（OR=75.5, CI=5.6–1015, p=0.003）。患者中位年龄54岁（范围20-85），82.2%超过40岁，男女比例1:1.16。84%患者曾接受输血/血制品，但无显著差异（OR=2.66, CI=0.15–48.8, p=0.59）。HBV与非HBV患者间肝酶水平无显著差异（表2）。66例（45%）显示基础免疫（抗-HBs≥10 IU/mL），但免疫状态在HBV与非HBV患者间无显著差异（OR=0.81, CI=0.16–4.1, p=1.0）。除2例外，所有患者报告完成全程HBV疫苗接种。158例中32例（20%）抗-HBc阳性，在HBV与非HBV患者间差异显著（OR=8.86, CI=1.5–50.8, p=0.016）。32例抗-HBc阳性者中9例（27%）无保护性免疫（抗-HBs<10 IU/mL），提示既往HBV暴露。

表3总结了HBV阳性病例的人口学特征及血清分子标志物，包括年龄、性别、HBV标志物、PCR结果及疫苗接种状态。所有患者PCR均阳性，呈现多种标志物组合模式（如HBsAg、抗-HBc、抗-HBs）。

3.2. 全基因组测序

采用7组引物测序HBV全基因组（表1）。Set 4（正向与反向）为本研究独家设计，Sets 2、3、5、6、7部分修饰（重设计单一引物）。4例样本成功完成全基因组测序，序列存入GenBank（登录号：PQ772197.1, PQ772198.1, PQ772199.1, PQ772200.1）。

3.3. 系统发育分析

对79条随机选自GenBank的HBV DNA序列（覆盖A-H基因型）进行系统发育分析，包括基于全基因组（2989nt）及S区（835nt）的ML系统发育树构建（支持图2、3）。WGS的ML树产生5个簇，大致对应已知基因型，其中D基因型进一步亚分为D1、D2、D3、D4、D5、D7亚型（支持图2），D4/D7亚型枝长短显示较低分歧及较近共同祖先，D1/D2亦有类似模式。F、G、H基因型落入同一簇，枝长较短。相比之下，S区系统发育树整体簇模式相同但分辨率更高，产生8簇，区分出G基因型（支持图3）。一例G基因型序列（AB625343.1）与F基因型聚类，提示潜在误分类。邻接（NJ）树呈现类似簇模式（数据未显示）。4条巴勒斯坦HBV全基因组（分属D1、D3亚簇）进一步进行系统发育树、单倍型网络及遗传多样性参数分析。分析包含23条DNA序列（含巴勒斯坦序列）。WGS与S区的ML系统发育树完全一致，均产生两簇（D1、D3亚型）（图1a、b）。4条巴勒斯坦序列平均分属两簇：簇I（D1）含13条序列（含PQ772199.1、PQ772200.1），簇II（D3）含10条序列（含PQ772197.1、PQ772198.1）。系统发育簇得到单倍型网络支持，WGS与S区均产生两单倍群，但S区更清晰（图1a、b）。

3.4. 遗传多样性

HBV-WGS与S区的遗传多样性参数显示两簇：I（D1）与II（D3）（表4）。WGS突变百分比16%（485/2989），S区8.5%（71/835）。总体及每簇中，WGS的遗传多样性（π）为S区两倍。WGS群体内随机两序列平均核苷酸差异百分比（K）为2%，S区为1%。作为主要多态性指标，分离位点（S）百分比在WGS（14%）高于S区（8%）。单倍型多样性（Hd）总体及每簇在WGS与S区间相同。两者Hd均高，而遗传多样性（π）低。簇I中两巴勒斯坦序列（PQ772199.1、PQ772200.1）高度相似，表现为低可变位点（S=3）、低遗传多样性（π=0.0036±0.001）及低突变数（Eta=3）。中性指数显示偏离中性（负值），WGS的Tajima’s D与Fu-Li’s F检验显著性水平不一，仅簇II的Tajima’s D（-0.68）与Fu-Li’s F（-0.50）无显著。S区簇I显著偏离中性：Tajima’s D（-1.89）、Fu-Li’s F（-2.50），总体S区亦显著（-2.77）。总体而言，WGS与S区或簇内Hd高、遗传多样性统计（π）低、中性检验负值（表4）。基于序列对间核苷酸差异方差的重组参数（R）为中等（∞>R>0），范围2.1-56.0。

按Wright分级系统，两靶标显示高Fst（>0.25）及中等Nm（0.25–0.99）。此外，群体间核苷酸差异平均比（Kxy）高，支持群体分化（表5）。相反，其他群体间指标（Dxy、Gst、Da）——为核苷酸替代与单倍型频率函数——较低（表5）。

4. 讨论

十余年前，研究团队曾报告巴勒斯坦北部HD患者HBV流行率约22.7%（8.2%显性感染，12.5% OBI）。当时高流行强调需严格HD单元感染控制以降低传播风险，包括实施感染预防协议及持续标准化HBV筛查。这些预防措施可能促成本研究观察到HBV流行率降至3.75%。全球范围内，HD患者HBV流行率差异大：巴西Tocantins报告从2001年4%降至2014-2015年0.8%；叙利亚大马士革多中心研究为3.2%；加纳7.7%；埃及Ismailia省近期研究高达19%。全球系统综述显示地域差异：亚洲7.44%、北美洲4.32%、欧洲7.07%、非洲5.52%、大洋洲8.45%、南美洲9.73%。这些变异归因于感染控制协议实施、全球血源病毒传播预防措施有效性、地方流行病学条件及诊断方法。本研究结果证实HD患者HBV流行率显著下降，凸显感染预防策略有效性。

本研究6例HBV中3例为OBI。3例OBI抗-HBc阳性，其中2例抗-HBs亦阳性。OBI流行率国际差异大，日本报告0.11%，伊朗高达30%。这种差异可能源于分子检测方法灵敏度及病例定义（以抗-HBc阳性病例或所有HD病例为分母估算）。

本研究中20%HD患者抗-HBc阳性，表明显著HBV暴露。类似结果见于巴西（12%）、伊朗（26.3%）、加纳（12.5%）及也门（47.5%）。这些差异可能源于HBV流行率、感染控制标准及诊断方法不同。HD患者抗-HBc率高持续凸显透析环境需改进感染预防措施。

本研究观察到免疫保护率仅45%接种HD患者达到抗-HBs≥10 IU/mL（保护阈值）。这与近期其他地区报告一致：加纳50.7%、巴西30%、伊朗66.3%。Tong等表明，免疫正常个体对乙肝的长期保护主要由免疫记忆介导，接种后抗-HBs≥10 IU/mL通常指示保护免疫。相反，免疫受损者（如HD患者）常无法维持持久免疫记忆，其抗HBV保护依赖循环抗-HBs抗体持续存在。另一研究显示，抗-HBs水平10-100 mIU/mL的HD患者常在1年内抗体滴度下降。此外，Ghadiani等证明即便接种，HD患者血清转化率仍显著低于一般人群。因此，HD患者低保护率强调需定期监测抗-HBs滴度及及时加强接种以维持该高危群体足够免疫力。

本研究基于WGS及S区的ML、NJ系统发育分析显示，4条测序HBV分离株属D基因型、D1与D3亚型。这与巴勒斯坦既往研究一致，均报告D基因型主导，D1亚型占约90%。D基因型是地中海及中东最流行HBV基因型。D基因型中，D1亚型是本区域最常报告亚型。相反，D3亚型在埃及、伊朗、巴西等多国有记录。

本研究中，WGS与S区的系统发育树及单倍型网络均未显示特定地理来源聚类模式，而是基于基因型/亚型（支持图2、3）。这得到其他HBV系统发育研究支持（靶向WGS或S区，基于NJ或ML法），表明存在基于基因型/亚型而非地理影响的簇。然而，更广泛研究将HBV基因型/亚型与地理分布关联。基于79条HBV DNA序列大数据集构建的系统发育树（ML、NJ）显示，分析S区时分辨率更高，产生8簇含多个明显亚簇，而WGS仅5簇。这与近期系统发育研究一致，强调S区基于系统发育分析对HBV基因/亚型分型具增强区分力。WGS与S区间这种差异的可能解释是大靶标（全基因组）对缺失数据容忍度高于小靶标（S区）。S区对缺失数据的不容忍使序列偏离从一簇落入另一簇。从G基因型偏离至F基因型簇的DNA序列因测序失败缺失8%（65nt）。无错误测序在群体遗传研究中起关键作用，尤其当调查DNA靶标小时，而全基因组调查可容忍。当正确测序的D1、D3簇（含4条巴勒斯坦序列）用不同模型（ML、NJ）及不同靶标（WGS、S区）分析时，产生完美匹配系统发育树，证实此点。S区单倍型网络更清晰，代表SNV的哈希标记及指示缺失个体的黑圈较少，而WGS单倍型网络因WGS较大尺寸含过多哈希标记及黑圈。准确WGS及足够调查个体（序列）数可产生合理完整单倍型网络。

至于遗传多样性及中性分析，两研究靶标（WGS、S区）及各簇显示高Hd值（0.98–1.00）、高h:n比值（0.9–1），同时低遗传多样性（π）值（0.007–0.027）（表4）。这些发现提示大多数DNA序列identical，任意两序列间轻微变异指示低多态性程度，群体中含许多紧密相关单倍型但不足展示真实遗传多样性。这表明HBV群体可能经历近期快速群体扩张，得到负Tajima’s D（-0.5至-1.86）及Fu-Li’s F检验（-0.5至-2.77）支持，簇I（D1）在两区域（WGS、S区）显著偏离中性（p<0.05）。这种快速扩张及增长引入新罕见突变，表现为WGS总突变数百分比高（16%）及S区（10%），高于通常百分比（各8%、4%）。此外，低遗传变异由群体内随机两序列平均核苷酸差异百分比低支持：HBV WGS（K=2%）及HBV S区（K=1%）。类似地，WGS可变分离位点（S）百分比14%，S区10%。Phan等研究930条HBV WGS发现多态分离位点（S）百分比19.6%，高于本研究。相反，该研究显示平均核苷酸差异数（K）为21，低于本研究（84）。HBV低遗传变异可能源于病毒紧凑结构（四大重叠基因）及类RNA病毒复制机制。紧凑结构导致所谓“受限进化”，使每位点核苷酸替代率低于RNA病毒，最终导致HBV群体较低遗传多样性。

重组参数（R）——依赖于群体大小及每序列重组率——既非零（无重组）亦非无限（自由重组），而是中间值。S区遗传重组（R=29.9）高于全基因组（R=11.7）（表4）。R增加（>0）提高基因重组可能性（通过HBV基因型共感染间水平DNA转移），从而驱动新单倍型产生、加速遗传多样化、群体扩张、进化瓶颈及近期正选择信号。群体间分化参数显示两靶标（WGS、S区）高Fst（0.39）。然而，Nm值非预期低（0.0–0.249）而是中等（0.39），指示群体分化可能发生在无或少量基因流（迁移）、群体内遗传漂变及遗传选择下。中等基因流（Nm）水平支持两靶标（WGS、S区）簇I（D1）与II（D3）间遗传分化（表5）。

本研究主要局限包括单中心设计、部分患者临床与人口学数据缺失、HBV阳性病例数少（降低统计效力）。此外，疫苗接种状态部分报告，未剂次记录不全。另一可能影响统计分析的限制是HD患者中OBI低流行率（本研究3.7%），导致95%CI范围宽（表2），对显著性精确水平有负影响。

5. 结论

HBV S区是群体遗传学研究的充分替代靶标，适用于WGS不可及场合。HD人群中OBI高率代表关键挑战，必须纳入HBV消除策略制定与实施。此外，使用扩增较短片段引物组为HBV全基因组测序提供经济、敏感、可扩展方法，尤其适用于低病毒载量样本。

伦理声明

研究获巴勒斯坦卫生部批准（参考号：162/1481/2022），授权使用匿名临床样本及患者数据。

同意

所有参与者获取口头同意。

利益冲突

作者声明无利益冲突。

作者贡献

Kamal Dumaidi与Abedelmajeed Nasereddin贡献相等。

资助

本研究未获资助。

支持信息

图1：基于片段大小及PCR条带强度的扩增产物。采用安捷伦4200 TapeStation系统对HBV PCR产物详细分析。图2：基于HBV基因组全基因组序列的最大似然（ML）系统发育树。使用MEGA-X基于79条WGS构建的1000次bootstrap一致ML系统发育树。图3：基于HBV基因组S区的最大似然（ML）系统发育树。使用MEGA-X基于79条S区序列构建的1000次bootstrap一致ML系统发育树。