应用CK17、MEP1A、PAX8、SMAD4和CDX2五标志物免疫组化组合精准鉴别卵巢黏液性癌与胰腺导管腺癌转移

本文推荐一种新型五标志物免疫组化组合（CK17、MEP1A、PAX8、SMAD4、CDX2），可高效区分卵巢黏液性肿瘤（OMT）与转移性胰腺导管腺癌（PDAC），总体准确率达91.8%，为临床病理诊断提供重要工具，尤其适用于形态学重叠的疑难病例。

　　

Abstract

Aims

转移性胰腺导管腺癌（PDAC）虽不常见，但可累及卵巢，且与原发性卵巢黏液性肿瘤（OMT）的鉴别诊断存在挑战。本研究旨在开发一种辅助性免疫组化（IHC）组合以协助诊断，并验证转移性PDAC的形态学特征。

Methods and results

基于文献回顾，选取了六种IHC标志物（CDX2、CK17、MEP1A、MUC2、PAX8、SMAD4），在包含256例PDAC、102例卵巢黏液性癌（MC）和58例卵巢黏液性交界性肿瘤（MBOT）的组织芯片上进行染色。对16例PDAC卵巢转移灶、25例MC和9例MBOT的详细形态学特征进行了复查。我们确认，肿瘤大小小于13 cm、双侧性、卵巢表面受累、低倍镜下的结节性、浸润性侵袭、尽管存在囊腺瘤或交界区域但仍出现卵巢假黏液瘤、以及中度核异型性等特征，应引起对转移性PDAC的怀疑，并提示需使用推荐的IHC组合进行评估。采用递归分割法，由CK17、MEP1A、PAX8、SMAD4和CDX2组成的五标志物组合总体准确率为91.8%（95% CI 88.8%–94.3%），其中CK17的权重最高。CK17在80.9%的PDAC中表达，而在MC和MBOT中的表达率分别为18.6%和1.7%。

Conclusions

这是首个能够高精度区分PDAC和OMT的辅助性IHC组合。这些结果为针对卵巢肿瘤转移表现的复杂性量身定制诊断工作流程的进一步研究提供了信息。

Introduction

转移至卵巢的腺癌占所有卵巢肿瘤的比例不到5%，但占累及卵巢的浸润性癌的9%。原发部位的比例因地区癌症发病率而异。在亚洲，最常见的两个原发部位是结直肠和胃。然而，由于2022年原发性胃癌的年龄标准化发病率（每10万人）在亚洲（16.4）和北美（4.1）之间相差约4倍，因此转移性胃腺癌在北美要少见得多。相比之下，结直肠癌（包括阑尾癌）的发病率在北美（27.2）略高于亚洲（22.2），因此结直肠癌在卵巢转移中所占的比例更高。PDAC的发病率在北美（8.5）也高于亚洲（5.3），增加了北美转移性PDAC的比例，而在亚洲约为5%。来自胆道和乳腺癌的转移在北美也更常见，其他罕见原发部位包括小肠、肺、膀胱和子宫颈。由于目前对于同步发生的子宫内膜样子宫内膜癌（1级或2级）累及卵巢应归类为独立原发性肿瘤还是转移性疾病仍存在不确定性，目前报告的子宫内膜转移至卵巢的比例（约15%）未来可能会发生变化。

随着组织学标准（超越肿瘤大小、双侧性和辅助检测）的日益复杂化，区分原发性卵巢黏液性肿瘤（OMT）与转移性癌的准确性在过去几十年中有所提高。例如，简单的IHC标志物组合CK7和SATB2对区分OMT与来自结肠和阑尾的下消化道肿瘤具有很高的鉴别价值，但对上消化道肿瘤则不然。尽管OMT的确切细胞起源尚未解决，但OMT表现出与上消化道癌强烈的表型相似性。虽然相对少见，但区分OMT与转移性PDAC仍然是一个挑战，尤其是当卵巢肿瘤是隐匿性胰腺原发灶的首要线索时。尽管它们各自的原发部位在表型和临床上存在显著差异，例如PDAC具有显著的促纤维增生反应且预后比卵巢黏液性癌（MC）差，但当转移性PDAC累及卵巢时，与OMT存在显著的形态学重叠。在Meriden等人对35例转移至卵巢的胰腺胆管腺癌的研究中，报告称69%的病例显示囊腺瘤/交界性肿瘤样区域。提示转移的关键特征包括双侧性、中等肿瘤大小和浸润性侵袭。作者还在一些病例中使用SMAD4 IHC来确定胰腺起源。SMAD4的相对高度特异性在两项研究中得到进一步证实；然而，也强调了在HPV无关的胃型宫颈内膜腺癌中SMAD4异常缺失表达的潜在缺陷。在寻找其他IHC标志物的过程中，欧洲的一项合作研究发现PDAC与OMT相比，CK17表达存在显著差异，PDAC中的表达更高。我们自己的mRNA表达研究最近发现，与PDAC相比，MEP1A表达在OMT的mRNA表达谱中上调。虽然MEP1A是一个新标志物，但已有商业化抗体可用。由于之前的所有生物标志物研究主要集中在1或2个标志物上，本研究的主要目的是开发一种IHC组合来区分原发性OMT和转移性PDAC。次要目的是验证Meriden等人提出的形态学特征，这些特征会提示考虑转移性PDAC并触发额外的辅助检测。

Material and Methods

Study Population

使用了一个先前组装的包含102例MC和58例卵巢黏液性交界性肿瘤（MBOT）的队列。这些病例于1990年至2020年间在阿尔伯塔省诊断，是先前描述的阿尔伯塔卵巢肿瘤类型（AOVT）和卵巢黏液性（OVMU）肿瘤研究的一部分。先前已复查组织学切片，并排除了具有明显转移性腺癌形态学特征的病例。CK7和SATB2组合有助于排除转移性下消化道腺癌。为了比较，使用了一个包含256例原发性PDAC标本的队列，这些标本是2010年至2018年间在阿尔伯塔省卡尔加里Foothills医疗中心连续诊断的PDAC。对于IHC标志物分析，肿瘤标本用先前构建的组织微阵列（含三份0.6 mm芯针）代表。形态学特征复查包括1998年至2020年间诊断的16例PDAC卵巢转移标本，其诊断经组织学或放射学明显的胰腺原发灶证实。获得了阿尔伯塔健康研究伦理委员会（HREBA.CC-16-0159, HREBA.CC-16-0161, HREBA-CC-20-0356）的伦理批准。对这些存档标本给予了豁免同意。

Review of Morphological Features

对25例MC、9例MBOT和16例PDAC卵巢转移灶的一个子集进行了详细的形态学复查，由一名对诊断设盲的观察者使用一张具有代表性的全组织苏木精-伊红（H&E）切片进行。在可用的情况下，将大体描述纳入复查。评估了以下形态学特征：表面受累、低倍镜结节性、囊腺瘤或交界性肿瘤样结构、融合性或浸润性侵袭、腺纤维瘤背景、低级别、中级别或高级别核异型性、卵巢假黏液瘤、杯状细胞、分泌细胞特征和门部淋巴血管侵犯。在有10个高倍视野（40×，视野直径0.56 mm）上评估核分裂计数。

Immunohistochemistry: Marker Selection, Optimization, and Interpretation

基于对PDAC和OMT之间差异表达的标志物的文献回顾（表S1），我们选择了五种IHC标志物（SMAD4、PAX8、CDX2、MUC2、CK17）进行进一步分析。另一个候选标志物（MEP1A）先前是从我们自己的mRNA表达数据中发现的。MEP1A在MC中显示出比上消化道肿瘤更高的mRNA表达，并且在针对PDAC的单独分析中也显示出表达水平升高。IHC标志物（MUC2、CK17、MEP1A）针对正常组织对照进行了优化（图S1和S2）。在Dako Omnis自动染色机（Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA）上进行的免疫组化方案细节见表S2。最初对所有标志物（除SMAD4外）应用简化的3级评分系统。然后将这种3级评分判读（缺失 0%；局灶性 1%–49%；弥漫性 50%–100%）进一步二分为 absent（缺失）和 present（局灶性/弥漫性），适用于CK17（膜性）、MUC2（胞质）、MEP1A（膜性）、CDX2（核）和PAX8（核）。当肿瘤细胞显示阳性染色时，SMAD4表达判读为正常（保留）；当肿瘤细胞缺乏表达而内部对照阳性时，则判读为异常（缺失）。包含肿瘤细胞中SMAD4表达弱（模糊）的病例属于 equivocal（不确定）类别。

Statistical Analysis

分类标志物的差异通过Pearson卡方检验进行评估。连续数据使用方差分析进行比较。按组织型进行的生存分析使用Kaplan-Meier曲线和对数秩检验进行分析。MC进一步按分期（I期与II–IV期）分层，I期MC进一步按侵袭模式分层。终点是癌症特异性生存（即，因癌症死亡，排除其他原因）。构建了一个名义逻辑回归模型来预测肿瘤部位（二元结果：OMT vs. PDAC）。预测变量包括符合预定标准的二元IHC标志物（缺失/存在，SMAD4除外，它有三个类别）：OMT和PDAC之间的绝对表达差异≥20%，或对任一实体的特异性≥95%（表1）。模型中未包括协变量和混杂因素，因为临床/病理学协变量（例如，年龄、分期）无贡献。数据集被随机分为训练集（75%，122例OMT，192例PDAC）与验证集（25%，38例OMT，64例PDAC）。使用递归分割基于CART算法（分类和回归树）开发分层决策树，并通过最大似然比卡方统计量（G²）进行分割。相关的P值随后转换为Logworth，定义为–log10(P-value)。使用最小节点数阈值（>20）进行手动修剪。基于错误分类的病例计算总体准确度、敏感性和特异性（包括95%置信区间（95% CI））以评估测试性能。P值<0.05被认为显著。所有分析均使用JMPv14 (SAS)进行。

表1. 卵巢黏液性交界性肿瘤（MBOT）、卵巢黏液性癌（MC）和胰腺导管腺癌（PDAC）中免疫组化标志物表达的频率，P值为Pearson卡方检验

（此处省略具体表格数据，详见原文）

• ?

  排除不确定病例后。

Results

Cohort Characteristics

队列特征概述于表S3。PDAC患者的平均年龄为66.2岁（95%置信区间[CI] 65–68岁），显著高于MBOT患者（48.5岁，95% CI 45–52）和MC患者（53.3岁，95% CI 51–56岁，表S3）。就疾病分期而言，大多数MBOT病例在国际妇产科联盟（FIGO）I期诊断，仅两例分类为II期。类似地，大多数MC患者也在I期诊断（80.2%）。相比之下，大多数原发性PDAC病例（82.4%）在II期诊断（美国癌症联合委员会，第7版）。生存结局在各组间存在显著差异。原发性PDAC患者的癌症特异性生存中位时间仅为20个月（5年生存率10.6%，标准误（SE）2.4）。相比之下，MC患者的5年生存率为74%（SE 4.8），MBOT患者为100%（图1A）。然而，当MC患者进一步按分期（I期与II–IV期）分层时，II–IV期MC患者的5年生存率为30.8%（SE 13.5），中位生存期为22.1个月，与PDAC相似。具有浸润性侵袭模式的I期MC患者的5年生存率为50%（SE 15.8），而与具有融合性侵袭模式的I期MC患者（5年生存率87.3%，SE 4.5）形成对比（图1B）。

Features of Metastatic PDAC in Comparison to MBOT and MC

转移至卵巢的PDAC的平均肿瘤大小为9.4 cm（6/16 (38%) 肿瘤 >10 cm 且 3/16 (19%) 肿瘤 >13 cm），显著小于MBOT（18.6 cm）和MC（20.5 cm, P?

Expression of the 6-Marker Panel in Primary PDAC, MBOT, and MC

免疫组化上，所有六种标志物在OMT和原发性PDAC之间的表达均存在显著差异，其中CK17和MEP1A的差异最大（分别>60%和>40%，图5，表1）。IHC标志物染色的代表性示例如图S3所示。CK17表达在PDAC中显著更高（总计80.9%；56.3%局灶性，24.6%弥漫性）， compared to MC（18.6%；17.6%局灶性，1.0%弥漫性）和MBOT（1.7%，全部局灶性；P?P?P?P?P?=?0.0009；表1）。表S5显示了按MC内分期和侵袭模式进一步分层的标志物表达。仅SMAD4缺失在II–IV期MC中显著更高，而PAX8表达在浸润性MC中最高，其他标志物未见显著差异。

Algorithmic IHC Approach to Distinguish OMT from PDAC

当使用名义逻辑回归时，包含5种最具鉴别力的标志物（CK17、PAX8、MEP1A、SMAD4、CDX2）的训练集曲线下面积达到0.968，区分OMT与PDAC的总体准确率为92.8%（95% CI 89.9%–95.1%）（图S4）。在测试集中，该模型的总体准确率为91.2%（95% CI 83.9%–95.9%），对PDAC的敏感性为93.8%（95% CI 84.8%–98.3%），特异性为86.8%（95% CI 71.9%–95.6%）（表S6）。包含5种标志物的分层决策树产生了91.8%（95% CI 88.8%–94.3%）的总体准确率（图6，表S6）。图6显示，单一最有用的标志物是CK17，其单独使用的总体准确率为83.4%（95% CI 79.5%–86.9%，表S6）。虽然5标志物组合对PDAC的特异性（88.1%，95% CI 82.1%–92.7%）与单独使用CK17（87.5%，95% CI 81.4%–92.2%）相比相对未变（即，实际OMT被预测为转移性PDAC（假阳性）的概率相似），但5标志物组合的敏感性增加到94.1%（95% CI 90.5%–96.7%）， compared to 单独使用CK17的80.9%（95% CI 75.5%–85.5%），将假阴性（实际PDAC）减少了13%。没有第二个标志物与CK17组合能提高准确率；即使是MEP1A也不能改变单独使用CK17的多数预测。事实上，PAX8、SMAD4和CDX2仅在由MEP1A提供的上下文依赖性亚组中提供增量改进（图6）。例如，当CK17+/MEP1A?时，已经是>95%的概率是PDAC，没有标志物能增加此概率；但SMAD4缺失增加了CK17+/MEP1A+双阳性病例是PDAC的概率。类似地，虽然当CK17?/MEP1A+时，是OMT的概率>95%，但在CK17?/MEP1A?的背景下，PAX8倾向于OMT（图S5）。对3例具有异常SMAD4缺失的II–IV期MC进行针对性重新复查显示，2/3的病例在原发性卵巢肿瘤中显示浸润性侵袭灶和模糊的低倍镜结节性，这提示可能是实际的转移性PDAC。对10例随机选择的、未被IHC组合预测为OMT的OMT进行额外复查，未发现形态学或临床/结局方面怀疑误分类为转移性PDAC的情况。由于所有PDAC都是原发性PDAC，因此误分类为OMT是不可能的。

Discussion

我们的研究提供了一种系统方法，使用形态学标准进行初步筛查，以触发5标志物IHC组合（CK17、MEP1A、PAX8、SMAD4和CDX2），从而准确区分OMT和PDAC。

区分原发性OMT与累及卵巢的转移性PDAC虽不常见，但由于它们形态学特征重叠，仍然是一个诊断挑战。特别是在冰冻切片情况下，双侧性和肿瘤大小应纳入考量。在一项研究中，队列中的52例OMT无一例是双侧肿瘤，但由于我们的OMT队列缺乏侧别数据，我们无法确认100%的单侧性。根据我们的经验，极其罕见的OMT可能是双侧的，例如所谓的双侧卵巢“亲吻性病变”。然而，我们系列中25%的转移性PDAC也是单侧的。已经提出了几个肿瘤大小的阈值（例如10或13 cm）来区分OMT与一般的转移性腺癌。正如Yemelyanova等人所推荐的，13 cm的截断值似乎是一个更平衡的阈值，我们的数据在PDAC的背景下也支持这一点。与OMT相关的特征，如囊腺瘤和交界性结构以及中度核异型性，在与MBOT或MC的一些单独比较中，在转移性PDAC中以相同的频率被观察到。转移性PDAC中这些具有欺骗性的温和结构学和核特征被描述为成熟现象。我们证实，更具体、提示PDAC的特征包括Meriden等人先前描述的那些特征，包括卵巢表面受累、低倍镜结节性和浸润性侵袭灶。虽然敏感性不高，但广泛的卵巢假黏液瘤也应引起对PDAC的怀疑。因此，Meriden等人描述的特征可用于对病例进行分诊，以便使用以下辅助检测进行进一步评估。

如前所述，没有单一的辅助性IHC标志物能够准确区分PDAC和MC；然而，我们采用文献中最有前景的标志物组成组合的方法，提供了有用的区分准确率。使用决策树，我们报告的准确率为91.8%，其中CK17和MEP1A成为关键的区分标志物：CK17阳性伴MEP1A阴性强烈预测PDAC，而CK17阴性伴MEP1A阳性则提示OMT。这一发现与这些标志物的已知表达模式一致，因为MEP1A mRNA表达在OMT中更常见，而CK17在胃肠道和胰腺肿瘤中已有报道。CK17的表达频率与Dundr等人报道的一致，我们的研究中PDAC为80.7% compared to 73.7%，MC为18.6% compared to 20.4%。

虽然单独使用CK17的准确率为83.4%，但依次添加MEP1A、然后PAX8、SMAD4和CDX2将逐步提高准确率，尤其是将预测转移性PDAC的敏感性提高到94.1%。PAX8是苗勒管谱系的标志物，在一部分OMT中表达，在PDAC中基本缺失，但它对OMT并非完全特异，因为在我们系列中3%的PDAC也有表达。值得注意的是，PAX8在分化良好的原发性胰腺神经内分泌肿瘤中经常表达。SMAD4缺失在PDAC中常见，提供了额外的诊断价值。然而，应注意异常的SMAD4并非完全对PDAC特异，正如先前研究也报道的那样。虽然作为杯状细胞标志物的MUC2表达在OMT中略高（符合预期），但在此背景下其鉴别价值有限。

我们的研究强调了结合形态学和IHC分析的多模式方法对于准确分类的重要性。应评估形态学以提出转移性PDAC的鉴别诊断。具有可疑转移的组织学特征的病例可能需要进行上胃肠道的进一步临床评估。在这种情况下，病理报告历来包含一条评论：“只有在临床排除胃肠道原发性肿瘤后，才应考虑此肿瘤为原发性卵巢肿瘤。” 所提出的IHC算法现在可以进一步为这种区分提供信息，从而提高诊断准确性并指导适当的临床管理。未来的分子谱分析研究可能会进一步增强我们的理解并帮助完善诊断标准。然而，仅靠突变分析不太可能可靠地区分这些实体，因为它们通常都共存KRAS和TP53共突变。突变分析可用于确认SMAD4突变的存在（这在OMT中不常见），并用于区分双重原发癌和转移性疾病以建立克隆关系。更有前景的途径可能涉及全局甲基化谱分析，它能提供关于细胞起源的见解。

作为一个局限性，我们仅评估了原发性PDAC上的IHC标志物，假设标志物表达在原发和转移部位之间是一致的。我们的发现为区分PDAC与OMT的IHC组合的表达频率提供了一个基准，需要在转移性PDAC标本中优先进行前瞻性验证。虽然所有转移性PDAC都有确认的原发性PDAC，但由于我们队列的回顾性性质，我们不能完全排除一些误分类的转移性PDAC被纳入OMT病例的可能性。实际上，对13例被IHC组合错误预测的OMT病例进行针对性重新复查，引起了对其中2例误分类的怀疑，这表明我们组合的准确率是一个保守估计。进一步的限制是基于每例病例单张代表性H&E切片进行形态学评估，这是由回顾性、基于人群的研究设计所限制的。虽然这种方法可能低估了局灶性特征的普遍性，但应用于转移性PDAC和对照OMT的一致方法确保了比较分析在统计上仍然有效。

值得注意的是，虽然我们的研究侧重于OMT与PDAC的头对头比较，但这种受限范围并不能完全反映临床诊断挑战，因为OMT必须与广泛的转移性腺癌谱相区分。我们的发现并不声称所确定的形态学或IHC特征是转移性PDAC独有的；而是强调了在此特定比较中的鉴别性标志物。需要未来纳入多样化转移病例（包括胃、肝胆和结直肠原发癌）的研究来完善诊断算法。例如，这种方法可以将形态学与高度特异的IHC标志物（例如，用于结直肠/阑尾转移的CK7/SATB2或用于乳腺癌原发灶的GATA3/ER）相结合。此外，CK17、MUC5AC、MEP1A、PAX8和CDX2在区分PDAC与胃或肝胆腺癌方面的效用需要进一步验证。这些努力将推动针对转移表现的复杂性量身定制的上下文驱动诊断工作流程的开发。

Conclusions

总之，我们的研究结果支持实施5标志物IHC组合（CK17、MEP1A、PAX8、SMAD4和CDX2），以在根据形态学标准选择的病例上有效区分OMT与转移性PDAC。

Author contributions

E.Y.K和M.K.构思了研究设计。A.D.B.和E.Y.K.参与了病例选择、复查和免疫组化评分。A.D.B.和M.K.分析了数据。N.S.M.和K.L.G.对研究设计和分析提供了关键反馈。C.H.L.和P.M.提供了病例。A.D.B.撰写了手稿初稿；所有作者都对手稿做出了贡献并批准了最终版本。

Acknowledgements

这项工作得到了阿尔伯塔精密实验室内部研究支持RS20-602的支持。Nicola S. Meagher得到癌症研究所NSW早期职业奖学金（2024/ECF 2024/1005）和卵巢癌研究联盟（导师指导研究者基金，MIG-2025-2-1954）的支持。

Conflict of interest

MK是Helix biopharma、AbbVie、AZ、Merck和GSK的顾问。