喀麦隆甲型H3N2流感病毒全基因组演化动态与抗原漂移机制研究

本综述系统解析了2023–2024年喀麦隆A/H3N2流感病毒的全基因组演化特征，揭示了关键抗原位点突变（如HA1-A202D/N161S、NA-H275Y）对病毒进化（3C.2a分支形成）及耐药性的影响，为疫苗株筛选和抗病毒策略提供关键分子流行病学依据。

　　

背景

流感病毒感染对人类生命健康构成严重威胁，全球每年约记录10亿例季节性流感病例，其中重症病例300–500万，导致29–65万呼吸相关死亡。自1968年出现以来，H3N2病毒高度流行，其H3血凝素（HA）和N2神经氨酸酶（NA）表面糖蛋白是这些毒株的主要蛋白。HA作为主要表面抗原，包含五个抗原位点：Region A（138, 142, 144, 145位氨基酸）、Region B（128, 156, 159, 160, 186, 198）、Region C（45, 48, 50, 53, 278, 280, 311, 312）、Region D（171, 212, 214, 219, 230, 246）和Region E（62, 75, 78, 94, 260, 261）。季节性变异的主要驱动因素之一是抗原漂移。

材料与方法

研究获得杜阿拉大学伦理与机构委员会批准（3971CEI-Udo/07/2023/M），在2023年1月至2024年12月期间，从喀麦隆19个流感哨点监测点采集急性呼吸道感染（ARI）患者的鼻咽拭子。病毒RNA使用QIamp viral RNA Kit提取，通过qRT-PCR进行流感病毒检测和分型/亚型分型。对Ct值<30的33份阳性样本进行全基因组测序，使用牛津纳米孔技术（Oxford Nanopore Technologies）平台和SQK-LSK109试剂盒。序列比对使用MAFFT软件，进化分析使用MEGA 11软件的最大似然法（ML），通过1000次bootstrap重复评估树拓扑的稳健性。蛋白三维结构（HA:4O5N, NA:1ING, MP:8RNG）从PDB下载，使用PyMOL 2.6.1进行可视化和注释。

结果

3.1. 研究人群的社会人口学特征

33份纳入研究的样本中，90%来自门诊患者（ILI），9%来自住院患者（SARI）。患者年龄1–90岁，57.6%为女性。肌痛、咳嗽和呕吐是90%患者的主要症状。5–14岁年龄组感染最多（18/33），其次是0–1岁组（10/33）。大多数流感病例出现在10月至12月。

3.2. 流感A/H3N2病毒的核苷酸多样性

首次在喀麦隆成功测序33个A(H3N2)病毒全基因组。33个毒株间八个基因片段的核苷酸相似性为98.1%–100%，与疫苗株A/Darwin/6/2021相比，核苷酸相似性为98.1%–100%，编码蛋白的氨基酸（AA）相似性为97.3%–100%。

3.3. H3N2流感病毒的遗传变异与进化分析

所有喀麦隆序列均属于进化枝3c.2a。HA基因均属于亚支3c.2a1b.2a.2a.3a.1，其余整合毒株进化出 distinct 进化枝，其HA基因属于亚支3c.2a1b.2a.2a.1b、3c.2a1b.2a.2b和3c.2a1b.1a。对八个片段序列的系统发育分析揭示了四个不同的进化亚支。

3.4. 通过AA取代和系统发育树分析HA、NA和MP基因的亚支

与2024疫苗株A/Darwin/6/2021相比，33个毒株在HA1中均出现I208F、K156I、E66K、N112S、G69N、V239I、K292E、Q189R、G241D、A202D、T3A、S70R、N161S、N138D、N394S、N120D、A16T、G78E和T144E等AA取代。70%的毒株属于亚支3c.2a1b.2a.2a.3a.1，30%属于3C.2a1b.2a.2a.3。重要的A202D和N161S突变导致病毒毒力增强，并分别促成新进化枝3C.2a1b.2a.2a.3和3c.2a1b.2a.2a.3a.1的产生。

在NA蛋白中，观察到I469T、I65V、P45S、I392T、L140I、L338V、H150R、K400R和H275Y等位点取代。30%的喀麦隆毒株存在H275Y取代，该取代与对神经氨酸酶抑制剂（NAI）、特别是奥司他韦的主要耐药性相关。

在MP蛋白中，观察到N85S、L59I、D24N、V27I、Y52C、S31N、F54L、L25P、S82N和E66K等位点取代。在一些喀麦隆毒株中注意到主要取代S31N，该取代已知可赋予对金刚烷胺的高水平耐药性。

3.5. 循环毒株与A/Darwin/6/2021疫苗株在八个基因中AA取代的比较分析

与疫苗株相比，在大多数HA1基因样本中检测到前述突变。突变分析扩展到其他七个病毒基因（PB2、PB1、PA、NS、NP）。在NP基因中观察到总共9个AA取代（E220D、L418I、L136M、I186V、A129S、N432S、S482N、K236R、S359L）。在PA基因中观察到总共18个AA取代（S402A、G684R、K142N、E101G、M311I、R605K、K142N、R213K、G99E、A660S、I407S、C321Y、A20T、K269R、K497R、R158K、Y277H、L400I）。在PB1基因（V200I、S375N、R386K、V527I）和PB2基因（R340K、D87N、V461I、N107D、T147I、M410V、L384F）中也观察到新的AA取代。在NS基因中也鉴定出大量突变， notably 取代E152D、N207H、I18V、N127S、N26K、A60V、R227G、I33L、I124M、A82V、V171I、L14S、K88R。总体而言，循环毒株与疫苗株之间观察到的AA突变数量较多，表明循环毒株将偏离2023–2024年的疫苗株。

3.6. HA、NA和MP蛋白的三维结构

对进化枝3C.2a1b.2a.2a.3a.1中序列的HA、NA和MP蛋白进行了三维结构建模。HA蛋白表现出数个突变，包括I208F、K156I、E66K、N112S、G69N、V239I、K292E、Q189R、A202D、T3A、S70R、N161S、N138D、N394S、N120D和G241D。在NA蛋白中，鉴定出I469T、P45S、I65V、H275Y、I392T、L140I、L338V、H150R和K400R等突变。此外，M蛋白在N85S、L59I、D24N、V27I、Y52C、S31N、F54L、L25P、S82N和E66K等位点显示出变异。

讨论

流感病毒RNA基因组的复制与相对较高的突变率（2.3 × 10^?5）相关，主要是因为病毒RNA依赖性RNA聚合酶缺乏3′–5′核酸外切酶活性，导致无校对功能。本研究是喀麦隆流感H3N2基因组特征的第二份报告。在分离毒株的HA基因中，观察到E66K、I208F、N112S、N394S、G241D、G69N、K156I、V239I、K292E、Q189R、N175S、R108K、G291D和A202D等重要取代。其中重要的A202D和N161S突变导致病毒毒力增强，并分别促成新进化枝3C.2a1b.2a.2a.3和3c.2a1b.2a.2a.3a.1的产生。这些发现与2012年中国南方的观察结果形成对比。

2023–2024流感季节在喀麦隆循环的绝大多数病毒属于进化枝2（完整分类3C.2a1b.2a.2），并获得了数个AA取代。不同的HA亚支在世界上不同地区被发现，具有来自几个亚支的HA基因的病毒以不同比例在几个地理区域共循环。在此期间共循环的具有进化枝2 HA基因的病毒中，三个亚支占主导地位：2a.1b、2a.3a.1和2b。其中，亚支2a.3a.1（包括超过70%的喀麦隆毒株）在全球占主导地位。这些病毒主要在非洲、亚洲、北美和大洋洲检测到。

30%的喀麦隆毒株（即10/33）在823位有一个点突变（胞嘧啶到胸腺嘧啶），导致NA的AA序列275位组氨酸被酪氨酸取代（H275Y）。该取代被报道在ARI患者中赋予超过1.5%的奥司他韦耐药性。还注意到在许多先前喀麦隆毒株的M2蛋白中存在的S31N取代（赋予对金刚烷胺的耐药性）的缺失。数据反而证实了V27I突变的存在，该突变引起对金刚烷胺的强表型耐药性，其水平与S31N突变相似。

结论

2024年分离的大多数喀麦隆毒株中存在大量2023年毒株中缺失的取代突变，清楚地表明在喀麦隆循环的A/H3N2毒株在不断进化。这一发现强调了对季节性流感病毒进行系统基因组监测的必要性，以评估流感感染负担并采取有效的国家流感控制和预防策略。