黑桤木与杂交桤木基因型的消毒效率及其对体外种子萌发的调控作用

本综述通过体外筛选实验，系统评估了不同桤木（Alnus）基因型（包括黑桤木、灰桤木及其杂交种）在消毒效率、真菌敏感性及对邻近种子萌发和幼苗发育的调控作用。研究发现，桤木基因型19–43–8?K具有最佳消毒抗性，而杂交基因型026在促进共生菌（Frankia spp.）互作和缓解生物胁迫（如枝孢菌Cladosporium cladosporioides）方面表现突出，为桤木抗逆育种和森林生态恢复提供了重要基因资源和理论依据。

　　

引言

黑桤木（Alnus glutinosa）和灰桤木（Alnus incana）作为河岸生境的先锋树种，具有重要的生态价值，其自然分布遍及欧洲全境。气候变暖导致树种分布范围发生变化，杂交现象日益频繁，对生物多样性产生深远影响。非生物胁迫（如干旱和湿润）可能促成黑桤木与灰桤木的基因库整合，从而增强对这些环境因素的适应性。渐渗杂交通过产生新基因型为森林进化带来益处，提升树木遗传多样性以应对不断变化的环境条件。然而，树木杂交也可能导致遗传侵蚀，甚至引发桤木灭绝的风险。此外，桤木杂交还面临本地病原真菌的威胁，例如杂交卵菌 Phytophthora?×?alni 及其相关物种 P. plurivora 和 P. lacustris 已在欧洲导致桤木种群显著衰退。另一类对幼树造成严重损害的真菌是枝孢属（Cladosporium），其影响树木根系并阻碍树木与根际的氮交换。枝孢菌 Cladosporium cladosporioides 是一种生态范围广泛的真菌物种，可作为多种植物的内生菌。以往研究表明，它是桤木属物种的天然内生菌，通常在老年或成熟桤木中无症状且无害，但在幼苗或免疫未成熟的树木中可能表现为机会性病原体。随着土壤和气候条件的变化越来越有利于病原体对桤木的攻击，研究树木杂交种的遗传多样性以评估其对威胁的响应变得愈发重要。

树木通过化感作用影响生态系统动态，这是一个植物释放次生代谢物以影响邻近生物生长和发育的生化过程。这些效应主要归因于酚类和类黄酮化合物，它们可以通过落叶、根系分泌物和分解植物材料释放到环境中。此外，某些植物物种（包括树木）可以与固氮细菌形成复杂系统。桤木与弗兰克氏菌（Frankia）属的固氮放线菌形成基于根系的共生关系。放线菌能够将氮气还原成铵，通过树木细胞的铵转运蛋白 AmtB 直接输出。为了储存氮，树木可以形成称为根瘤的特殊器官，近年来对宿主植物与弗兰克氏菌之间的共生相互作用进行了深入研究。植物-细菌共生还通过丰富根际使森林生态系统受益。作为交换，放线菌从宿主植物获得碳、能量和受保护的生态位。理解桤木如何影响种子萌生的共生机制对于森林管理、保护和生态恢复至关重要。

通过体外筛选实验，可以研究消毒效率、植物生长以及诱导其他植物发育的能力。本研究假设不同的桤木基因型和春物候在真菌污染敏感性以及影响种子萌发和幼苗发育能力方面存在差异。为了验证这一假设，本研究聚焦两个主要目标：评估经过标准化表面消毒协议后黑桤木和杂交桤木基因型在真菌污染水平和叶片出现方面的变异，以提高微繁殖成功率；评估不同基因型外植体如何影响体外条件下种子萌发率和幼苗形态参数。

材料与方法

植物材料与对象

从位于立陶宛中部K?dainiai地区Josvainiai长老会的种子园中5年生树木上收集了13种不同桤木（Alnus）基因型的种子和营养芽。该林业种植园共种植了28个黑桤木无性系、12个杂交无性系和19个灰桤木无性系。每个无性系种植了2至9棵树，种植间距为5?×?8?m。实验分析仅选择那些在春物候点数（早春或晚春物候）表现出极端值的桤木基因型，该点数由LAMMC森林遗传与树木育种部门的研究人员于2017年测定。春物候评估基于桤木叶片萌发情况，评分范围从1（低：芽刚开始破裂）到5（高：叶片绿色且牢固保持）。采样在11月进行，环境条件以凉爽温度（4°C–5°C）和中等湿度为特征，月平均降水量为20–40?mm。所有选定的树木均表现健康，无可见疾病症状。选择了5种具有高春物候点数（H）的黑桤木基因型、4种具有低春物候点数（L）的黑桤木基因型以及4种黑桤木?×?灰桤木杂交种（Hb）。

实验设计

消毒与桤木营养外植体种植

从13种不同基因型中取40个桤木营养芽（n?=?520），采集后在冰箱（+4°C）中储存7天。随后，使用无菌注射器对外植体进行化学溶剂消毒：Ace（50%商业漂白剂）2分钟，75%乙醇3分钟，0.1% AgNO₃ 3分钟。每次化学处理后，外植体均在消毒蒸馏水H₂O中浸泡（Ace后2分钟，乙醇后3?×?3分钟，AgNO₃后3分钟）。消毒后，将外植体种植到圆柱形管中，用无色塑料盖封闭，放入5?mL高压灭菌的木本植物培养基（WPM）中进行体外筛选。用于培养桤木外植体的玻璃培养管直径为20?mm，高度为150?mm，内含5?mL WPM。

WPM（Lloyd and McCown 1980）用作营养培养基，由基础盐混合物（Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Germany）提供，并添加标准浓度的维生素（Duchefa Biochemie, Netherlands）、20?g?×?L^?1蔗糖（Duchefa Biochemie, Netherlands）和4?g?×?L^?1结冷胶（Duchefa Biochemie, Netherlands）。初步研究使用了pH值为3.7、4.3、4.9和5.5的WPM。种子萌发最佳且污染最少的pH值为4.9，因此该pH值用于本研究的后续实验。

真菌污染与桤木植物形态测量

在将外植体种植到WPM后1、2和4周，评估了13种桤木基因型中每个营养外植体的真菌污染频率（污染?=?1，未污染?=?0）。在外植体种植到WPM后2周和4周评估了桤木外植体的叶片出现频率。种植后8周评估了每个外植体的叶片数量和最大叶宽。

真菌增殖与鉴定

选择最常与桤木外植体污染相关的真菌物种进行进一步分析。在层流条件下，通过无菌切取菌丝块并将其放置在琼脂表面中心，将培养物从圆柱形培养管转移到含有马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）的无菌培养皿中。

为了鉴定从桤木外植体中分离出的真菌物种，使用针对真菌组织优化的CTAB方案从纯真菌培养物中提取DNA。使用NanoDrop One分光光度计（Thermo Scientific, Rochester, NY, USA）评估DNA浓度和纯度，260/280比值在1.8至2.0之间的样品用于下游分析。使用通用引物ITS1和ITS4扩增核糖体DNA的内部转录间隔区（ITS），该区域是广泛使用的真菌条形码。PCR以95°C初始变性5分钟开始，随后进行30个循环的95°C变性30秒、56°C退火30秒和72°C延伸30秒，最后在72°C终延伸7分钟。产物经纯化后送至Macrogen测序中心（Amsterdam, Netherlands）进行双向Sanger测序。使用Chromas 2.6.6分析序列色谱图，并将反向读段转换为互补序列以便与正向读段比对。使用BioEdit 7.2.5进行手动序列校正和共有序列构建。通过将所得共有序列与NCBI GenBank数据库使用BLASTn算法进行比较，进行分类学鉴定。该真菌分离株被鉴定为Cladosporium cladosporioides，与参考序列具有100%序列一致性和100%查询覆盖率。代表性ITS序列已保存在GenBank中，登录号为MT609901.1。

桤木外植体对种子萌发的影响

选择三种不同的黑桤木基因型23–95–5?K（H4）、4–139–4?K（L1）、19–43–8?K（L4）和一种黑桤木?×?灰桤木杂交种026（Hb3）用于进一步评估外植体对其它桤木种子萌发增强和诱导防御病原真菌Cladosporium cladosporioides的能力。基因型的选择基于外植体对污染的敏感性，从每个春物候组和杂交桤木中至少选择一种表现最佳的基因型。将外植体转移到新的相同类型圆柱形管中，其中装有新鲜高压灭菌的WPM。在接种前对外植体进行枝孢菌筛查，仅使用未感染该真菌的外植体。桤木种子与芽在同一时间从同一种子园采集，在种植到WPM培养基前在冰箱（+4°C）中储存8周。桤木种子用96%乙醇消毒3分钟。使用玻璃棒加入一滴洗涤剂Tween，并将种子在30% H₂O₂中浸泡2?×?80分钟。然后，将三颗桤木种子种植到每个管的WPM中，以60°角围绕一个生长7周的桤木外植体放置。每个基因型桤木外植体的一半圆柱形管接种枝孢菌（3颗种子?×?13管 [八管有枝孢菌接种物，八管无真菌接种物]?×?5个变量 [对照； H4, L1, L4, Hb3]； n?=?240）。作为对照，将三颗桤木种子种植到WPM中，中间无桤木外植体。种植种子后1周和2周评估种子萌发情况。种植后8周测量苗长、主根长和最长的侧根长度，并评估侧根数量。

统计分析

使用R（版本4.2.1）和RStudio（版本1.1.456）以及Microsoft Excel for Microsoft 365进行数据分析。

记录每个桤木营养外植体的真菌污染状态（污染?=?1，未污染?=?0），针对13种基因型在三个时间点：种植到WPM培养基后1、2和4周。根据物种和春物候将基因型分为三大类（H、L和Hb）。计算每个基因型和每个大类在每个时间点的真菌污染频率。对于组间比较，在基因型大类之间和个体基因型之间进行配对Fisher精确检验。使用Benjamini–Hochberg（BH）方法对p值进行多重比较调整。使用multcompView包分配显著性分组，字母表示基因型?×?污染组（污染或未污染）之间统计相似或不同的组（α?=?0.05）。使用ggplot2生成条形图，显示平均污染率及标准误差条。

叶片出现频率数据被视为二元结果（1?=?存在； 0?=?不存在）。对于每个基因型和时间点（种植后2周和4周），计算具有叶片出现的外植体比例，并在污染和未污染外植体之间进行比较。使用与计算真菌污染频率相同的统计方法，计算每个基因型和大类在每个时间点的叶片出现频率。

为了评估基因型之间在桤木叶片数量和最大叶宽方面的差异，分别对两个变量应用Kruskal–Wallis检验。作为事后检验，执行Dunn检验与Bonferroni校正，以确定配对差异。使用紧凑字母显示总结结果，其中不同字母表示基因型?×?污染组（污染或未污染）之间统计显著差异（p?

为了评估不同桤木基因型对体外种子萌发和植物形态性状的影响，选择了四种基因型（H4、L1、L4和Hb3）。一半外植体接种了枝孢菌。使用Fisher精确检验与BH校正确定统计显著性（p?

使用双向方差分析（ANOVA）评估基因型、枝孢菌接种及其相互作用对植物形态参数的影响。当ANOVA表明显著效应（p?

使用桤木植物的形态参数，包括苗长、主根长、侧根数量和侧根长度，进行主成分分析（PCA）。使用prcomp函数执行PCA，变量经过缩放和居中处理以确保无论单位或大小如何均具有同等贡献。PCA用于降维并评估与真菌接种（枝孢菌）与非接种对照相关的样本变异模式。使用ggfortify包中的autoplot函数生成PCA双标图。样本以X形点表示，根据接种状态进行颜色编码。通过黑色加载向量和标签可视化性状贡献，指示每个参数对主成分影响的方向和强度。所有绘图均使用ggplot2包完成。

结果

真菌污染频率

在将外植体体外种植到WPM后1、2和4周，评估了13种基因型中每种桤木营养外植体上病原真菌污染的频率。在种植后1、2或4周，大类基因型组（H、L和Hb）之间未观察到真菌污染率的显著差异（p?>?0.05）。在整个观察期间，三种不同桤木基因型中确定了最广泛的真菌污染：26–133–9?K（L2）、4–139–4?K（L1）和桤木杂交种048（Hb4）：1周后—L2 42.9%、L1 30.2%和Hb4 23.8%；2周后—L2 69.1%、L1 34.9%和Hb4 52.4%；4周后—L2 83.3%、L1 48.8%和Hb4 61.9%。相反，种植4周后，桤木杂交基因型041（Hb1）和047（Hb2）的真菌污染最少（真菌污染频率分别为18.6%和23.8%）。

桤木叶片发育

为了评估外植体春物候、基因型和真菌污染对桤木外植体叶片发育的影响，在转移到WPM培养基后2周和4周评估了叶片出现频率。在两个时间点，真菌污染显著（p?

分析不同桤木基因型的叶片发育发现，真菌污染对种植后2周的叶片出现有显著影响（p?

在外植体种植到WPM后8周评估了每个桤木外植体的叶片数量和最大叶宽。在未污染和污染样品中，大类基因型组（H、L和Hb）之间在每个外植体的叶片数量和最大叶宽方面未观察到显著差异（p?>?0.05）。黑桤木基因型19–43–8?K（L4）的外植体在两个实验变量（未污染和污染）中均以每个外植体叶片数量最多而著称（未污染中每个外植体4.7?±?0.4片叶，污染中每个外植体3.3?±?0.2片叶）。黑桤木基因型4–139–4?K（L1）的外植体在未污染样品中每个外植体仅有2.2?±?0.2片叶，在污染样品中每个外植体仅有1.0?±?0.2片叶。L4基因型的黑桤木外植体具有最高的叶宽，未污染中平均为7.3?±?0.5?mm，污染中平均为7.1?±?0.7?mm。

桤木外植体对种子萌发和植物形态的影响

为了评估不同桤木基因型外植体诱导其它桤木种子萌发和改善植物形态参数的能力，选择了四种不同的桤木外植体基因型：23–95–5?K（H4）、4–139–4?K（L1）、19–43–8?K（L4）和026（Hb3），每个大类基因型组至少有一种。一半实验管接种了病原真菌枝孢菌。种植种子后1周和2周测定桤木种子萌发频率。所有选定的不同桤木基因型外植体在接种枝孢菌的管中均提高了桤木种子萌发频率（与对照相比提高：H4 43.3%、L1 35.0%、L4 38.8%和Hb3 32.7%）。L4基因型桤木外植体在种植种子后1周对诱导种子萌发频率影响最大（与对照相比提高38.8%）。L1基因型桤木外植体在无接种物的管中诱导了种植种子后2周的种子萌发频率（提高29.8%）。

种植种子后8周评估了桤木植物形态参数（苗长、主根长、最长侧根长度和侧根数量）。所有四种选定的不同桤木基因型外植体对接种枝孢菌的桤木植物的主根长均有显著（p?

主成分分析

进行PCA以探讨接种枝孢菌和未接种样品中四个植物生长参数之间的关系：苗长、主根长、侧根长度和侧根数量。前两个主成分（PC1和PC2）分别解释了总方差的48.7%和22.1%。双标图揭示了一个清晰的聚类趋势，其中接种和未接种样品在PCA空间中占据了部分不同的区域，表明真菌接种影响了多变量性状谱。双标图中的向量方向表明，苗长、侧根数量和侧根长度呈正相关，对PC1有中等贡献。相比之下，根长对PC2的贡献更强，并与其他参数显示出部分正交关系，表明了一种独特的变异模式。

讨论

以往对桤木（桦木科）物种黑桤木和灰桤木的研究主要集中在其分布范围及未来可能的变化。然而，黑桤木更常见于潮湿地点，而灰桤木更常见于较干燥地点；气候变暖改变了它们的自然栖息地，导致更频繁的杂交。幼桤木幼苗高度易感真菌疾病。黑桤木?×?灰桤木杂交种可能是更具适应性的树种，对各种害虫和病原体具有更好的抵抗力。然而，桤木对生物和非生物因素的抗性高度取决于其表型可塑性。因此，需要测试潜在的桤木杂交基因型，这些基因型应具有更好的生长和抗性特性。在我们的研究中，我们分析了四种桤木杂交基因型，使用体外筛选实验评估了它们的消毒效率以及桤木杂交种对诱导其它桤木外植体种子萌发率和生长参数的影响。相比之下，选择了五种具有早春物候的黑桤木基因型和四种具有晚春物候的基因型。

尽管微繁殖技术允许我们测试新的树木基因型，但它面临限制和挑战，例如植物污染病原真菌，导致猝倒症状。在我们的研究中，进行了初步实验以研究桤木外植体的消毒方法和时间，以最小化污染风险，同时最小化对树木发育的影响。比较基于早和晚春物候的桤木，以及黑桤木与杂交种，在消毒成功率方面未发现差异。然而，使用组织培养的树木外植体成功消毒主要取决于树木基因型。我们的结果显示，在所有13种选定的桤木基因型中，四种桤木杂交外植体基因型中有三种受病原真菌污染最少。然而，第四种桤木杂交基因型的污染率第二高。这一发现与其他研究一致，表明树木杂交种在使用体外筛选实验评估时，根据其基因库的不同，也可能抗污染性较差。树木杂交种可能携带来自两个亲本物种的更多内生真菌，可能增加微繁殖中的污染风险。

植物对真菌病原体的敏感性随着它们经历不同的物候阶段而变化。以更快生长和发育为特征的植物也可能更易感病原体，因为它们的生长-防御权衡可以解释它们将内部资源用于生长 versus 防御和抗性。这些机制已在温室条件下确定，并进行了深入的体外分析，包括蛋白质信号。我们的结果与这些研究一致，表明在没有病原真菌污染的情况下，桤木杂交种047（Hb2）和026（Hb3）的外植体比黑桤木基因型19–43–8?K（L4）的外植体具有更高的叶片出现率。然而，在黑桤木基因型19–43–8?K（L4）中确定了最高的对病原真菌耐受性。这些L4外植体表现出更高的叶片出现率、每个外植体更多的叶片数量和增加的叶宽。这证实了杂交植物可能比黑桤木生长和发育更快，但变得对真菌污染更敏感且对病原体耐受性更低。然而，这取决于具体的树木基因型。桤木春物候分析显示，具有早春物候的基因型在