综述：细胞疗法对癫痫动物模型发作影响的系统评价和荟萃分析

本综述系统评价了细胞疗法在慢性癫痫动物模型中减少发作的疗效，荟萃分析显示总体发作频率降低54.8%（95% CI=48.1–61.5），异质性高（I2=87.1%）。研究揭示了癫痫特异性、动物特异性和细胞移植特异性因素是异质性的主要来源，为临床转化提供了关键洞见。

　　

Abstract

本研究旨在系统评价细胞疗法在慢性癫痫动物模型中减少发作的疗效。通过检索三个数据库（Ovid MEDLINE、Ovid Embase 和 Web of Science）并依据预设标准，共纳入30项临床前对照研究进行系统评价和随机效应模型的荟萃分析。结果显示，与对照组相比，细胞移植后发作频率总体降低了54.8%（95%置信区间=48.0558–61.5455），研究间异质性为87.1%。荟萃回归分析揭示了七个显著的研究特征（可分为癫痫特异性、动物特异性和细胞移植特异性三类）是异质性的来源。在红藻氨酸（kainic acid）诱导的慢性内侧颞叶癫痫（MTLE） Status Epilepticus 模型中，通过静脉途径递送细胞并以发作频率作为测量指标时，观察到最大的发作减少。胚胎干细胞（ESC）移植在减少发作方面显示出最佳疗效。

Key points

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  我们的荟萃分析显示，在慢性癫痫动物模型中，细胞移植后发作总体减少54.8%（95% CI=48.1–61.5）。

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  当细胞通过静脉递送、以发作频率作为测量指标时，在红藻氨酸诱导的慢性 TLE Status Epilepticus 模型中观察到最高的发作减少。

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  大多数研究使用了 MGE 祖细胞，其显示出中度的发作减少。

1 INTRODUCTION

再生医学的最新进展为开发基于细胞的疗法（cell-based therapies）作为耐药性癫痫（drug-resistant epilepsy）的潜在疾病修饰治疗（disease-modifying treatment）提供了机遇。细胞移植是治疗多种神经系统疾病的一种有前景的治疗策略。其基本原理在于，干细胞能够分化为不同的细胞类型，以替代在获得性癫痫（如内侧颞叶癫痫（MTLE）中海马区）中受损或丢失的细胞。在慢性癫痫动物模型和MTLE患者切除的海马中，均观察到特定类型的抑制性γ-氨基丁酸能（GABAergic）中间神经元（如生长抑素和 parvalbumin 阳性神经元）的显著丢失，这可能改变了致痫神经元网络中兴奋与抑制的平衡。大脑皮质的 GABAergic 中间神经元主要来源于内侧节隆起（medial ganglionic eminence, MGE），是新皮层和海马中抑制的主要来源。通过基于干细胞的移植来替代这些丢失的 GABAergic 中间神经元，可能为改善 MTLE 患者的发作、认知和精神共病结局提供一种创新策略。反映这种方法潜力的一个例证是，一项由商业赞助的首个人体 I/II 期临床试验（NCT05135091）正在进行中，旨在评估 MGE 来源的 GABAergic 中间神经元对耐药性 MTLE 患者的效果。此外，一些小型、非对照、开放标签的临床研究也报道了细胞移植治疗癫痫，特别是耐药性癫痫的潜力。然而，仍需进一步研究以确定该方法在人类中的安全性和有效性，并优化细胞类型、移植部位等关键参数。

为优化该方法的临床转化，需要对相关临床前研究的质量和结果进行系统评估。因此，本系统评价和荟萃分析旨在：(1) 得出细胞移植在癫痫动物模型中疗效的汇总估计值；(2) 确定动物实验在何种条件下显示出最大疗效；(3) 确定研究质量对报告疗效的任何影响。我们的主要研究问题是：细胞疗法是否能减少临床前癫痫模型的发作频率和持续时间？

2 MATERIALS AND METHODS

2.1 Protocol approval and registration

本系统评价的方案根据 PRISMA-P（系统评价和荟萃分析方案优先报告条目）指南制定，并在 PROSPERO（CRD42018103628）正式注册且已在同行评审期刊上发表。

2.2 Definitions

我们将“出版物”定义为一项独立的研究工作（包括摘要），每篇出版物可能呈现来自多个实验的数据。每个实验可能报告不同实验组（例如，不同细胞类型或移植细胞数量的疗效）的结果。我们将这些定义为独立比较（independent comparisons），并相应地提取数据，在荟萃分析中调整权重以考虑每个对照组相关的治疗组数量。

2.3 Identification of relevant studies

使用预定的纳入和排除标准，我们通过检索三个电子数据库（Ovid MEDLINE、Ovid Embase 和 Web of Science）来识别所有相关出版物。初始检索于2019年3月进行，并于2024年5月更新。使用了扩展的检索词，包括癫痫相关术语（如“epilepsy”、“temporal lobe epilepsy”、“seizure”等）和干细胞/细胞疗法相关术语（如“stem cells”、“cell therapy”、“cell transplantation”等），并限制为体内动物研究。

2.4 Inclusion and exclusion criteria

我们纳入了报告细胞移植在癫痫动物模型中疗效的对照研究，其结局表示为发作的变化，并且可以确定每组动物数量、平均效应大小及其方差。我们将搜索限制在红藻氨酸、毛果芸香碱和遗传性癫痫模型，排除了点燃模型（kindling），因为后者通常不表现出自发性发作。排除了不包括载体治疗的研究；干预不涉及细胞疗法的研究；主要结局不是癫痫的模型研究；人类研究；未使用脑电图（EEG）测量主要结局（发作）的研究；综述、社论和书籍。本系统评价仅纳入使用 EEG 作为发作检测方法的研究，以减少方法学变异并确保发作量化的准确性和一致性。

2.5 Outcomes measured

结局包括通过 EEG 测量的发作持续时间、发作频率、发作时间和发作总次数，以评估细胞移植后的发作变化。

2.6 Publication selection

使用 Covidence 软件管理检索到的出版物。去除重复后，对剩余研究进行标题和摘要筛选，然后是全文筛选。两位作者独立审查标题、摘要和全文，分歧由第三位评审员解决。对符合条件的研究进行数据提取。

2.7 Data extraction

使用预定义的数据提取 Excel 表格进行数据提取。提取的数据包括出版物详情（发表年份、标题、第一作者）和与研究干预相关的特征（动物模型、癫痫模型、细胞组织来源、细胞剂量、给药时间、单次或多次给药、细胞来源物种、给药途径、靶向区域、评估时间）。有利结局定义为发作持续时间、频率、时间和总次数的减少。此外，从每个干预组（对照组或细胞治疗组）提取了平均±方差。使用数字像素标尺从表格和图表中提取数据。

2.8 Evaluation of risk of bias

使用 SYRCLE 偏倚风险（RoB）工具评估纳入动物研究的方法学质量，该工具源自 Cochrane RoB 工具，适用于动物干预研究。它评估10个偏倚领域（包括选择偏倚、实施偏倚、测量偏倚、 attrition偏倚、报告偏倚等）。两位评审员独立评估每项研究，分歧通过共识解决。

2.9 Data analysis

对于每个独立比较，计算了归一化效应大小（ESi；归一化均数差），作为治疗组相较于载体组的结局改善或恶化的百分比。

公式为：ESi = [(Xc - Xrx) / Xc] × 100

其中 Xc 和 Xrx 分别是对照组和治疗组的平均报告结局。

为处理研究报告多个实验组时数据可能存在的非独立性问题，将共享的对照组数据平均分配到相关的治疗组中。对于报告多个时间点结局的研究，仅将最终时间点纳入分析，以保持一致性和减少研究内依赖性。

使用 DerSimonian and Laird 随机效应加权均数差来计算效应大小（改善百分比）的汇总估计值及其95%置信区间（CI）。使用 I² 统计量评估纳入研究间的异质性程度。进行亚组荟萃分析和荟萃回归以进一步阐明异质性的来源（显著性水平 p < .05），通过计算调整后的 R² 值来确定模型可解释的总异质性百分比。然后根据动物物种/品系/年龄、癫痫模型、细胞组织来源、细胞类型、细胞剂量、细胞来源物种、给药途径、靶向区域、评估时间、给药方案和测量的结局类型进行分层分析。数据以条形图呈现。通过漏斗图和 Egger 回归检验发表偏倚。所有分析均使用 Camarades 荟萃分析工具完成。

3 RESULTS

3.1 Study selection and characteristics

通过电子检索共识别出7006篇出版物。去除1029篇重复后，对5977篇进行标题和摘要初筛。245篇全文符合前瞻性纳入标准，最终排除5731篇出版物。最终，30篇出版物纳入评价，包含75个独立比较，共1306只动物。第一篇符合标准的研究发表于2004年，研究了神经干细胞（NSCs）在成年 Status Epilepticus 大鼠模型中的抗癫痫发生潜力。此后又有29篇出版物发表。采用了多种细胞类型，包括 MGE 祖细胞（8篇）、NSCs（7篇）和骨髓来源的间充质干细胞（BMSCs，7篇）。大多数细胞来自原代组织（20篇），其余11篇使用细胞系。细胞剂量范围从1万到1000万个细胞，单次给药（14篇）或多次给药（15篇）。细胞通过静脉或颅内注射（靶向杏仁核、黑质、新皮层、皮层和海马）移植。动物模型包括大鼠（10篇）和小鼠（21篇）以及各种品系。诱导癫痫的方法有三种，毛果芸香碱最常见（16篇），其次是红藻氨酸（12篇），基因修饰模型使用较少（3篇）。发作频率是最常见的发作评估指标（21篇），其次是发作持续时间（17篇）。这些发作结局在急性期（30天内）或慢性期（>300天）进行评估。

3.2 Internal validity and publication bias

对所有30篇纳入出版物进行了偏倚风险评估。报告质量参差不齐。虽然大多数研究报告使用了随机化和盲法，但未提供足够的实施细节。此外，大多数研究未明确说明是否处理了不完整的结局数据，使得 attrition偏倚风险不明确。很少研究描述了对结局评估者设盲或分配隐藏。这些发现突显了在解释结果时应考虑潜在的偏倚来源。只有一篇纳入出版物报告了所有这些旨在最小化偏倚的措施。漏斗图不对称表明存在发表偏倚，Egger 回归证实了这一点。Trim and fill 统计识别出9项缺失研究，效应大小从54.8%降至54.2%。

3.3 Impact of various aspects of study design

在所有30篇出版物中，细胞移植后发作总体减少54.8%（95% CI=48.0558–61.5455）。研究间存在显著异质性（I²=87.1%, p < .0001）。荟萃回归显示七个研究特征显著解释了观察到的研究间异质性（见表S3），可分为三大类：癫痫特异性、动物特异性和细胞移植特异性。

3.3.1 Epilepsy-related characteristics

分析发现，用于评估发作减少的结局指标和诱导癫痫的模型显著贡献于研究间异质性（R² 值分别为48.17%和32.46%）。在评估的结局中，细胞移植的最大效应见于测量发作时间（time spent in seizure）的研究，显示平均减少62.69%（95% CI=41.25–83.28），但该结局仅在4个独立比较（80只动物）中评估。最常报告的结局指标是发作频率减少，占纳入研究的50%以上（33个独立比较，618只动物）。

关于癫痫诱导方法，红藻氨酸和毛果芸香碱给药是最常用的（69个独立比较，1194只动物）。其中，红藻氨酸模型在细胞移植后显示出最显著的发作减少，平均减少53.67%（95% CI=46.29–61.05）。

3.3.2 Animal-related study characteristics

动物物种似乎未显著影响异质性，但动物品系贡献了 R²=56.34%。在免疫缺陷（NOG）小鼠模型中观察到最显著的发作减少，平均减少79.04%（95% CI=54.83–103.24），但该品系仅用于一篇出版物（4个比较，62只动物）。除该研究外，还有三篇研究使用了免疫缺陷小鼠，显示的发作减少范围很广（58.78% 至 -4.52%）。

在大鼠品系中，Sprague Dawley 和 Wistar 最常用（35个独立比较，723只动物），显示中度发作减少（平均减少分别为47.66%和62.49%）。值得注意的是，两者都是野生型，且未使用免疫抑制来促进细胞移植。

3.3.3 Cell transplantation-related study characteristics

与细胞移植相关的研究特征是研究间异质性的最大来源，其中移植细胞类型的贡献最大（R²=68.68%）。在评估的细胞类型中，人类皮质 MGE 型 GABAergic 中间神经元细胞和胚胎干细胞（ESC）显示出最显著的发作减少（平均减少分别为88.38%和87.15%），但这些细胞仅在4个独立比较（73只动物）中评估。大约一半的比较使用了 MGE（19个独立比较，247只动物）或神经干细胞（NSCs，14个比较，352只动物）。

海马是最常靶向的移植部位（57个独立比较，868只动物）。海马移植导致发作平均减少52.58%（95% CI=50.56–54.59）。

通过静脉输注或微注射给药细胞显示出近似相似的改善（分别改善66.13%和51.33%）。有趣的是，单次剂量注射与更大的发作减少相关（平均减少57.67%），而多次注射平均减少49.09%。

未检测到动物模型、细胞来源、细胞剂量、给药时间或评估时间对异质性有贡献。

4 DISCUSSION

细胞移植已成为一种有前景的癫痫疾病修饰疗法，通过各种潜在机制（如替代丢失细胞、修复细胞、重组突触连接、调节神经递质和神经营养因子）有效且持续地减少发作发生。一些小型开放标签临床研究支持移植多种类型干细胞控制发作的治疗潜力。最近发表的一篇系统评价报告称，干细胞疗法是耐药性癫痫患者的一种潜在有效治疗选择，但临床环境中当前可用的数据有限且质量低。

在当前的工作中，我们总结了通过系统评价确定的30项临床前研究的数据，这些研究评估了细胞移植在减少慢性癫痫动物模型发作方面的疗效。荟萃分析显示细胞移植后发作发生总体减少了54%。然而，研究间存在显著异质性（I²=87%），突显了临床前癫痫细胞疗法文献中实验设计和方法的变异性。

我们的研究结果表明，当细胞通过静脉递送、以发作频率作为测量指标时，在红藻氨酸诱导的慢性 MTLE Status Epilepticus 模型中观察到最高的发作减少。有趣的是，细胞移植并未显著减少遗传性癫痫模型的发作。缺乏显著疗效可能反映了干细胞移植疗法在伴有细胞丢失的局灶性损伤性癫痫（如 MTLE）中更有效，而非在动物模型或患者的遗传性癫痫中具有更广泛的抗癫痫作用。这强化了细胞移植方法在获得性、“损伤性”癫痫（如 MTLE、创伤性脑损伤或中风）中的潜在治疗效用，并表明临床试验中需要仔细的患者分层。

大多数研究使用了 MGE 祖细胞，其显示出中度的发作减少。移植细胞的抗癫痫机制尚未完全了解，其效果可能是由于旁分泌机制，包括局部细胞迁移和随后神经营养因子的释放。例如，将 MGE 祖细胞移植到癫痫啮齿动物的海马区可显著减少发作频率并使行为正常化，可能是通过释放抑制性神经递质和促进神经元健康与突触整合的营养因子。此外，人类脐带血来源的单核细胞通过类似机制与神经保护作用相关，在癫痫模型中促进神经发生和减少神经元损伤。这些机制将与整合细胞自身的直接效应互补，需要进一步研究以阐明精确机制。

细胞剂量、干细胞给药时间和结局评估时间等因素似乎不太重要。细胞移植后治疗效果的持续时间仍然是一个重要的考虑因素。在本荟萃分析中，我们仅纳入了每项研究中评估的最终时间点，这限制了我们分析治疗效果时间进程的能力。然而，由于所有研究都报告了其最新随访的结局（在一些研究中长达移植后6个月），观察到的效应不太可能是短暂的。这表明细胞移植可能具有持续的治疗影响。尽管如此，未来需要具有延长纵向随访的研究来更全面地描述治疗效果的持久性和进展。值得注意的是，最出乎意料的发现之一是，只有极少比例的研究使用了免疫缺陷动物或实施了免疫抑制。尽管如此，缺乏免疫抑制似乎并未对细胞移植的治疗结果产生负面影响，这表明至少在啮齿动物中，即使没有免疫调节，移植物存活和功能整合也是可以实现的。这一发现值得进一步研究，特别是在将基于细胞的疗法转化为临床应用的背景下，因为对患者而言，最小化免疫抑制治疗的需求将是一个巨大优势。

尽管这些发现为设计临床试验提供了宝贵的指导，但在改善内部有效性和后续发表偏倚风险方面的重视仍然有限。我们使用 SYRCLE 工具进行的偏倚风险评估揭示了纳入研究中的若干方法学局限性，特别是在不完整的结局数据和选择性报告方面。大多数研究未清楚报告数据是否缺失或如何处理，这引入了关于 attrition偏倚的不确定性。同样，在没有预先指定方案的情况下，选择性报告偏倚难以评估。这些局限性强调了在临床前动物研究中提高透明度和方法学严谨性的必要性。此处观察到的高发表偏倚风险可能归因于许多研究，特别是那些结果不利的研究，仍未发表。

特别值得注意的是 Bershteyn 等人最近发表的研究，该研究提供了关键的临床前证据，用于指导目前正在进行的、由 Neurona 赞助的首个人体 I/II 期干细胞移植治疗癫痫（特别是单侧 MTLE）的临床试验。该临床前研究使用了红藻氨酸诱导的 Status Epilepticus 慢性 MTLE 模型、NOG 免疫缺陷小鼠品系，将修饰过的人类 MGE 祖细胞移植到海马中。值得注意的是，它是唯一一项获得最高质量评估分数（7分）的研究，表明其方法学严谨性最高。该研究报告的估计发作减少率为88%，是纳入研究中观察到的最显著效应之一。

我们的评价方法有一些局限性。系统评价的性质是对文献的观察性而非实验性评估，因此我们只能报告关联而非因果关系。尽管我们的检索策略设计得全面，但一些研究可能被无意中遗漏。然而，我们的研究很可能涵盖了该领域的大部分报告，代表了迄今为止关于干细胞在癫痫中应用的最彻底的评价。该分析的另一个局限性是缺乏关于行为发作类型的标准化报告（例如，局灶性与全身性，电图表性与运动性）。这限制了我们对其进行荟萃回归表征的能力，否则本可以提供关于细胞疗法对特定发作类型差异疗效的见解。未来的研究应旨在一致地记录发作特征，以支持更详细和信息丰富的分析。由于这些局限性，从这项工作中产生的假设需要通过严格设计、足够效力的头对头实验（head-to-head experiments）来验证。

尽管如此，我们的分析为细胞疗法作为慢性癫痫患者，特别是获得性癫痫（如 MTLE）的一种疾病修饰治疗方法的前景提供了支持。特别是，我们的研究结果表明，将 MGE 祖细胞移植到红藻氨酸诱导的 Status Epilepticus 慢性 MTLE 动物模型中可显著减少发作频率，支持了移植细胞替代癫痫灶中丢失和受损组织、恢复正常脑功能的假说。这一点非常重要，因为已知这种 GABAergic 神经元群在耐药性慢性 MTLE 患者中受影响最严重。