孕妇粪便来源的细胞外囊泡体外调控T细胞向妊娠支持表型转化及其免疫机制研究

本文首次揭示孕妇粪便细胞外囊泡（fEVs）通过调控T细胞亚群分化（Th2/Th17平衡），促进妊娠免疫耐受的新机制。研究建立标准化fEVs分离方案，证实其可被T细胞快速内化，并通过蛋白质组学分析发现关键信号通路（如RAS/STAT5）参与调控，为微生物组靶向干预妊娠并发症（如子痫前期）提供理论依据。

　　

3.1 粪便细胞外囊泡的分离与表征

研究团队建立了从保存粪便样本中分离fEVs的标准化方案。通过比较六种不同处理方案（Protocol I-VI），发现超速离心法较ExoQuick沉淀法可获得更高蛋白产量（图S1A）。最终确定采用DNA/RNA Shield保存样本并结合Protocol II沉淀法的优化方案。纳米颗粒追踪分析（NTA）显示每克粪便中可提取中位数1.1×10¹¹个囊泡，平均尺寸124nm（图1A-C）。透射电镜（TEM）证实囊泡呈典型圆形结构，尺寸范围26-121nm（图1D）。蛋白含量检测显示每克粪便含2.0mg蛋白（图1E）。ELISA检测证实囊泡含有革兰阴性菌内毒素（ endotoxin）和革兰阳性菌脂磷壁酸（LTA）（图1F,G），Western blot未检测到β-肌动蛋白污染（图1H）。蛋白质组学分析显示仅3%肽段来源于人类蛋白质组，证实囊泡主要成分为细菌源性。

3.2 孕妇与非孕妇来源fEVs的生物学特性比较

通过qPCR检测发现，孕妇组fEVs中 Fusobacteria 门16S rRNA丰度显著降低（图2E）。16S rRNA测序显示在属水平存在显著差异：非孕妇组 CAG:56、vadinBE97 和 Tyzzerella 富集，而孕妇组 Dorea、Izemoplasmatales 和 Eubacterium xylanophilum 等菌属增多（图S3）。值得注意的是，两组在囊泡数量（1.14×10¹¹ vs 8.86×10¹⁰/g）、蛋白含量（11.23±6.96 vs 10.92±1.01mg/g）、内毒素（1.30±0.53 vs 0.80±0.049EU/g）和LTA（20.96±5.71 vs 21.02±5.89pg/g）水平均无显著差异（图2F-I）。

3.3 fEVs对T细胞表型的差异化调控

CFSE标记实验证实fEVs可被T细胞快速摄取，1小时达到峰值（图3A-C）。流式细胞术分析显示，与非孕妇来源fEVs相比，孕妇来源fEVs刺激后：CCR4⁺/CXCR3^-/CCR6^- Th2细胞比例显著升高（图3E）；CCR4⁺/CXCR3^-/CCR6⁺ Th17细胞比例降低（图3F）；而Th1（CCR4^-/CXCR3⁺/CCR6^-）和T_reg（CD25⁺）细胞无显著变化（图3D,G）。细胞内细胞因子检测进一步证实IL-4⁺ T细胞增加（图3I），而IFN-γ⁺、IL-17⁺和FoxP3⁺细胞无变化（图3H,J,K）。

3.4 蛋白质组学揭示差异表达信号网络

质谱分析鉴定到1407个蛋白质，其中51个在非孕妇组显著上调，35个在孕妇组上调（图4A,E）。GO分析显示两组在分子功能和生物过程类别存在显著差异（图4C,D）。关键发现包括：孕妇组calpastatin（抑制Th17分化）和S100A4（促进Th2极化）上调；非孕妇组Crk-like蛋白（与STAT5形成复合物）、Ras抑制蛋白1（RSU1）、Src激酶相关磷蛋白1（SKAP1）和干扰素诱导鸟苷酸结合蛋白2（GBP2）等促炎信号分子显著富集。这些蛋白通过调控JAK2/STAT5、RAS/ERK等信号通路影响Th细胞分化命运。

4 讨论

本研究首次建立从常温保存粪便中分离fEVs的标准化方案，证实孕妇来源fEVs具有独特的免疫调节功能。尽管两组fEVs在物理特性方面相似，但其细菌组成（尤其 Fusobacteria 门）和免疫功能存在显著差异。孕妇fEVs通过上调calpastatin和S100A4、抑制RSU1/STAT5通路，促使Th细胞向Th2偏移并抑制Th17分化，这种调控模式与健康妊娠所需的免疫耐受状态一致。值得注意的是，fEVs中检测到的人类来源蛋白（CD9/CD63）仅占3%，表明观察到的效应主要源于细菌囊泡。

5 结论

孕妇肠道菌群通过释放特征性fEVs调控T细胞分化，促进妊娠支持性免疫表型形成。这为理解微生物-免疫互作在妊娠维持中的作用提供了新视角，并为开发基于微生物组的妊娠并发症（如子痫前期）干预策略奠定了理论基础。