人类rDNA间隔区编码新蛋白ORF3的发现及其在细胞衰老和癌变中的表达调控分析

本研究首次报道了人类核糖体DNA（rDNA）间隔区（IGS）中一个新型开放阅读框ORF3，其编码一个190个氨基酸的疏水蛋白。研究人员通过TAR克隆、Northern blot、Western blot及细胞定位等技术，发现ORF3在衰老细胞和病毒转化细胞中表达上调，且其核质分布受RNA复合物调控，为研究rDNA区蛋白编码功能及衰老相关分子机制提供了新视角。

　　

在真核生物中，核糖体DNA（rDNA）单元通常被认为是转录核糖体RNA（rRNA）的模板，而其间隔区（IGS）长期以来被认为主要产生非编码RNA。近年来，科学家陆续在rDNA间隔区发现了一些具有开放阅读框（ORF）的转录本，例如ORF1和ORF2（又称RIEP），它们编码的蛋白可能与热休克应答和线粒体功能有关。然而，rDNA是否还编码其他功能蛋白，其进化起源和生物学意义仍不清楚。

在这一背景下，研究人员通过对来自人-鼠杂交细胞中的人21号和22号染色体rDNA进行转化相关重组（TAR）克隆和测序，发现了一个全新的开放阅读框——ORF3。该ORF位于rDNA间隔区，可编码一个由190个氨基酸组成、分子量约为22 kDa的蛋白质。序列分析显示，该蛋白的N端和C端具有强疏水性，中间则嵌入了一段来自AluSx元件的亲水区域，整体结构非常独特。

为了探究ORF3是否真的被细胞表达，研究人员首先通过Northern blot在HEK293细胞中检测到长约2 kb的正义链转录本，进一步通过cDNA扩增和5′RACE验证其转录范围。随后，他们成功表达了带有V5标签的ORF3融合蛋白，并利用自制抗体在细胞内源蛋白中检测到ORF3的存在。有趣的是，该蛋白既存在于细胞核也分布于细胞质，但经RNase A处理后，核内信号显著减少，提示ORF3可能与RNA形成复合物。

研究人员还发现，ORF3的表达在不同细胞状态中存在显著差异：在复制衰老的WI-38成纤维细胞、依托泊苷、电离辐射或过氧化氢诱导的衰老细胞中，ORF3的mRNA水平明显上升。此外，在病毒转化的HEK293细胞中，ORF3也呈现高表达，暗示其可能与细胞应激、衰老乃至癌变相关。

为了追溯ORF3的进化起源，研究团队比较了多个人类和非人灵长类动物的rDNA序列。结果显示，ORF3的完整编码序列仅存在于人类和倭黑猩猩（bonobo）中，而在黑猩猩、大猩猩和猩猩中，同源区域存在移码突变或缺失，无法编码完整蛋白。这一发现表明，ORF3可能是在人类与倭黑猩猩分化后才获得完整编码能力的“年轻基因”。

该研究综合运用了TAR克隆、Northern blot、RT-qPCR、Western blot、免疫荧光显微技术、RNA干扰（使用LNA antisense oligos）以及生物信息学分析（包括RepeatMasker、AlphaFold结构预测和序列比对）等方法。样本来源包括人-鼠杂交细胞（含人21或22号染色体）、HEK293细胞、WI-38二倍体成纤维细胞以及公共数据库中的灵长类基因组数据（如CHM13端粒到端粒组装序列及HPRC联盟样本）。

ORF3在人类基因组中的分布与变异

通过分析CHM13单倍体细胞中的rDNA重复单元，研究人员发现ORF3完整拷贝主要集中在21号染色体上的串联重复簇中，其他染色体如13、14、15和22号也含有少量完整或截短版本。这些变异包括5 bp插入或缺失导致的移码突变，提示ORF3在人类群体中具有较高的多态性。

ORF3的转录不受RNA聚合酶I抑制，但可能在Pol II/III调控下表达

使用Pol I抑制剂BMH21处理细胞后，45S rRNA的转录被显著抑制，但ORF3的mRNA水平未受影响。相反，Pol II抑制剂DRB处理甚至引起ORF3表达上升，提示其转录可能依赖Pol II或Pol III，但常用Pol III抑制剂CAS 577784-91-9未能有效抑制ORF3及5S RNA，其确切机制仍需进一步研究。

ORF3在细胞衰老与转化中表达上调

在复制衰老及多种应激诱导衰老的WI-38细胞中，ORF3的mRNA水平显著高于增殖期细胞。同样，在病毒转化的HEK293细胞中，ORF3也呈现高表达，表明其表达与细胞状态转变密切相关。

ORF3蛋白定位受RNA调节

通过表达EGFP-ORF3融合蛋白并观察其分布，研究人员发现该蛋白在未处理细胞中同时位于细胞核和细胞质，而经RNase A处理后，核内信号消失，说明ORF3的核定位依赖于RNA或RNA-蛋白复合物。

ORF3在灵长类进化中出现较晚

序列比对显示，ORF3的完整编码能力仅存在于人类和倭黑猩猩，其他非人灵长类如同属大猿的黑猩猩、大猩猩和猩猩中，同源区域因插入、缺失或无起始密码子而无法编码全长蛋白，反映该ORF是在较近进化时期才形成功能基因。

本研究首次揭示人类rDNA间隔区中存在一个编码新型疏水蛋白ORF3的开放阅读框，其表达具有细胞状态特异性，尤其在衰老和转化细胞中上调。序列和进化分析表明，ORF很可能是灵长类进化过程中的“新生基因”，仅在人类和倭黑猩猩中保留完整形式。虽然其具体功能尚不明确，但该蛋白与RNA的相互作用及其在应激条件下的表达模式提示它可能参与转录调控、核质运输或细胞稳态维持。该研究不仅拓展了我们对rDNA功能复杂性的认知，也为探索衰老、癌症等过程中基因表达调控提供了新的分子靶点。

论文发表于《Journal of Molecular Evolution》，作者包括Yaohui Chen、Jung-Hyun Kim、Hee-Sheung Lee、Sergey Koren、Vladimir Larionov、Adam M. Phillippy、David Schlessinger和Ramaiah Nagaraja，来自美国国家卫生研究院（NIH）下属国家老龄化研究所（NIA）和国家癌症研究所（NCI）等机构。