海洋源浒苔多糖通过靶向抑制Akt1通路治疗去势抵抗性前列腺癌的研究

本综述系统阐述海洋源浒苔多糖（EP）通过直接结合Akt1蛋白并抑制其磷酸化（Ser473/Thr308），诱导G1/S期细胞周期阻滞（p27Kip1↑/Skp2↓/Cyclin A2↓）和抑制上皮间质转化（EMT）（E-cadherin↑/N-cadherin↓），从而显著抑制去势抵抗性前列腺癌（CRPC）细胞增殖（IC50=93.33μM）、迁移与侵袭的多重抗肿瘤机制，为海洋天然产物靶向治疗前列腺癌提供新策略。

　　

3.1 浒苔多糖（EP）抑制前列腺癌细胞增殖的机制

海洋源浒苔多糖（EP）对恶性前列腺细胞系表现出选择性细胞毒性，其中对DU145细胞的敏感性最高（IC₅₀=93.33±7.02μM），其次为PC3（164.92±21.03μM）和LNCaP（313.62±44.22μM）细胞，而对正常前列腺上皮RWPE-1细胞无明显毒性。通过实时细胞分析（RTCA）证实，100μM EP处理可显著降低DU145细胞增殖，200μM时则几乎完全抑制增殖能力。

BrdU脉冲实验显示，经100μM EP处理24小时后，BrdU阳性率从对照组的65%降至21%，表明DNA合成受到显著抑制。流式细胞术BrdU-PI双染色进一步揭示EP诱导G1/S期阻滞的具体机制：50μM和100μM EP处理后，S期细胞比例分别从对照组的46.7%下降至41.5%和24.7%，而G0/G1期细胞比例则上升至29.0%和34.4%。值得注意的是，高浓度EP组还出现G2/M期细胞群体的显著增加，提示EP对细胞周期存在多层面调控作用。

3.2 EP对癌细胞迁移与侵袭能力的抑制作用

通过划痕愈合实验和Transwell迁移/侵袭实验证实，EP能剂量依赖性地抑制DU145细胞的运动能力。100μM EP处理几乎完全阻断伤口愈合过程，而50μM浓度则表现出中度抑制效果。在无血清条件下的Transwell实验中，EP显著抑制由血清生长因子诱导的细胞迁移和侵袭，其中100μM浓度几乎完全阻断这两种能力，50μM浓度则使侵袭能力降低70%（迁移能力降低不足20%）。这种对侵袭能力的更强抑制效果表明EP可能通过干预上皮间质转化（EMT）过程发挥作用。

3.3 EP对G1/S期转换和EMT标志物的调控作用

qPCR分析显示EP处理显著上调CDKN1A（编码p27^Kip1蛋白）和E-cadherin表达，同时下调CCND1（细胞周期蛋白D1）、CCNA2（细胞周期蛋白A2）和MCM3（微小染色体维持蛋白3）的表达。Western blot分析进一步证实EP处理导致Akt1磷酸化水平显著降低，其下游靶蛋白Skp2和Snail表达量明显下降。与qPCR结果一致，S期关键蛋白Cyclin A2的表达也显著减少。

Skp2的减少导致其底物p27^Kip1的积累，这与G1/S期细胞周期阻滞现象一致。同时，EMT标志物N-cadherin的表达在EP处理后下降，而另一EMT标志物Vimentin的表达水平未发生明显变化，表明EP对EMT过程的调控具有选择性。

3.4 EP通过靶向抑制Akt1磷酸化发挥抗肿瘤作用

Akt1作为调控细胞生长、存活和细胞周期进程的关键激酶，其功能主要通过Thr308和Ser473位点的磷酸化实现。实验结果显示，EP处理显著降低磷酸化Akt1水平，而总Akt1蛋白量保持不变。环己酰亚胺（CHX）追踪实验表明，EP处理加速了Skp2蛋白的降解速率，同时使p27^Kip1蛋白稳定性增强。

细胞热转移分析（CETSA）直接证实EP与Akt1蛋白发生相互作用：加入50μM EP后，Akt1的热变性温度从54°C移至58°C，表明EP结合后增强了Akt1蛋白的热稳定性。有趣的是，虽然EP稳定了Akt1蛋白结构，但却几乎完全抑制了其磷酸化激活，提示EP可能通过变构调节机制抑制Akt1的激酶活性。

3.5 Akt1过表达可逆转EP介导的表型抑制

为验证Akt1是EP的直接作用靶点，研究人员通过外源过表达Akt1进行挽救实验。Western blot证实Akt1过表达有效逆转了EP对Akt1磷酸化的抑制。RTCA和BrdU实验进一步表明，Akt1过表达可抵消EP引起的增殖抑制表型。

BrdU-PI双染色分析显示，Akt1过表达不仅逆转了EP引起的G1/S期阻滞（G1期细胞比例从EP组的32.2%降至OE-Akt1+EP组的23.4%），还使G2/M期细胞比例增加至26.6%。这一现象可能与Akt1失活导致的Cdc25活性降低有关，后者无法有效去除CDK1（Tyr15）的抑制性磷酸化，从而引起G2期阻滞。另一种可能机制是Akt1活性降低增加了Cdc20表达，促进Cyclin B的泛素化降解，最终阻止细胞分裂。

Transwell实验最终证实，Akt1过表达显著恢复EP处理细胞的迁移和侵袭能力，从功能层面验证了Akt1作为EP关键靶点的可靠性。

4 讨论

本研究首次系统阐明海洋源浒苔多糖（EP）通过直接靶向Akt1蛋白，抑制其磷酸化激活，进而调控下游细胞周期和EMT相关通路，在多层面抑制去势抵抗性前列腺癌进展的分子机制。EP特有的硫酸化多糖结构可能为其与Akt1蛋白的特异性结合提供了结构基础，这种天然产物的多靶点调控特性为其作为前列腺治疗剂的开发提供了独特优势。

值得注意的是，Akt1信号通路在胰岛素受体信号传导和代谢稳态中发挥关键作用，因此在将EP推向临床应用时，需特别注意对合并糖尿病和肥胖症患者的安全性评估。未来研究应着重于EP的体内药效学评价和结构优化，以期开发出高效低毒的新型海洋源抗前列腺癌药物。