NHE6（SLC9A6）通过调控胰岛素信号通路和囊泡转运介导脂肪积累与葡萄糖稳态的机制研究

本刊推荐：本研究首次揭示内体Na+/H+交换器NHE6（SLC9A6）在脂肪积累和葡萄糖稳态中的关键作用。通过Nhe6KO小鼠模型和3T3-L1脂肪细胞实验，发现NHE6缺失导致脂肪积累减少、胰岛素信号通路（Akt磷酸化）受损、GLUT4储存囊泡（GSV）组分（sortilin/LRP1）降解增加。研究证实NHE6通过调节内体pH稳态控制胰岛素响应性转运蛋白（GLUT4/CD36）的膜 translocation 和稳定性，为 Christianson综合征（CS）患者的代谢异常提供了机制解释，并为肥胖和糖尿病研究提供了新视角。

　　

引言

内体pH的稳定依赖于质子泵（V-ATP酶）和质子泄漏途径之间的平衡。内体Na⁺/H⁺交换器（eNHE）是主要的质子泄漏来源，代表电中性Na⁺/H⁺交换器超家族中的一个独特且进化古老的亚型。在哺乳动物中，存在两种eNHE亚型：NHE6和NHE9，分布于早期内体和循环内体膜上，通过用阳离子替换腔内质子来调节内体pH（pH_endo）。NHE6的突变会导致罕见的X连锁疾病Christianson综合征（CS），其特征为智力残疾、自闭症和共济失调。尽管NHE6在多种组织中均有分布，但其在非神经系统中的生理作用尚未得到充分研究。CS患者常见的合并症是低体重，身体质量指数处于3-5百分位范围。本研究利用Nhe6^KO小鼠模型，探讨了NHE6在脂肪积累和葡萄糖稳态中的作用。

NHE6缺失导致小鼠年龄依赖性体脂减少

尽管出生体重相似，成年Nhe6^KO小鼠的体型小于野生型（WT）对照。通过间接热量测量系统和EchoMRI分析，发现3月龄小鼠在标准饮食（chow diet）下，两组体重和体脂无显著差异。然而，随着动物年龄增长，差异逐渐显现。6-7月龄时，Nhe6^KO小鼠的体重和脂肪质量显著低于同龄同性别对照动物，但瘦体重和总体水分未发生变化。食物摄入量相同，尽管Nhe6^KO小鼠的能量消耗范围更大。组织学分析显示，Nhe6^KO小鼠的棕色脂肪组织（BAT）中脂滴小而稀少，腹股沟白色脂肪组织（iWAT）和性腺白色脂肪组织（gWAT）中的脂滴平均尺寸显著减小。

高脂饮食下NHE6缺失小鼠脂肪积累减少

将5月龄小鼠置于高脂饮食（HFD，60%热量来自脂肪）15周后，对照组动物的体重增加显著大于Nhe6^KO小鼠。9月龄时，Nhe6^KO小鼠的体重和脂肪重量均较低，BAT、iWAT和gWAT的重量也较轻，但骨骼肌和脑质量无差异。H&E染色显示，敲除小鼠的棕色和白色脂肪中脂滴显著减小。总之，NHE6的缺失导致脂肪积累整体减少，且这种表型在HFD喂养下仍然存在。

Nhe6缺失小鼠肝脏和肌肉中糖原储存异常

通过高碘酸-希夫（PAS）染色评估糖原含量，发现HFD喂养的Nhe6^KO小鼠骨骼肌中糖原储存略有减少。肝脏染色显示，chow饮食下两组动物肝脏相似，但HFD下Nhe6^KO小鼠的脂肪积累明显减少。出乎意料的是，Nhe6^KO动物肝脏中的糖原储存呈现饮食依赖性差异：chow饮食下视觉上较低，而HFD下较高。血清葡萄糖水平评估显示，chow喂养的Nhe6^KO小鼠基线空腹血糖显著较高，但HFD喂养的Nhe6^KO小鼠较低。葡萄糖耐量测试表明，Nhe6^KO动物的葡萄糖处理呈现饮食依赖性改变，与肝脏糖原变化相关。肝脏中葡萄糖转运蛋白异构体2（GLUT2）的表达也呈现饮食依赖性变化，HFD下Nhe6^KO中GLUT2表达显著降低。

分化脂肪细胞选择性上调Nhe6

将3T3-L1成纤维细胞分化为脂肪细胞后，通过油红O染色和脂肪细胞标志基因（Slc2a4、Adipoq、Plin1、Plin2）的mRNA诱导确认分化成功。脂肪细胞分化伴随NHE6转录本近三倍增加，而密切相关的NHE9亚型的转录水平下降约50%，表明NHE6在脂肪细胞功能中具有亚型选择性作用。

NHE6敲低减少脂肪细胞中胰岛素依赖性脂肪积累

使用shRNA或siRNA敲低NHE6后，脂肪细胞标志物表达未变，但脂联素转录水平增加1.5倍。尽管脂联素增加，但油红O染色显示脂肪滴减少，电镜证实脂肪滴更小更少。这些体内发现表明NHE6在脂肪积累中具有细胞自主效应。BODIPY标记的C₁₂脂肪酸摄取实验显示，NHE6敲低脂肪细胞中的平均荧光强度显著降低，胰岛素刺激的脂肪酸摄取未显著升高。流式细胞术分析证实，与对照组相比，NHE6敲低细胞中与BODIPY C₁₂相关的荧光左移，且高荧光细胞百分比降低。CD36（一种促进长链脂肪酸摄取的清道夫受体）的细胞表面 translocation 实验显示，胰岛素处理可诱导对照组细胞中CD36的 translocation，但在NHE6敲低细胞中未观察到这一现象。

胰岛素处理增加质膜上的NHE6

蛋白质组学分析显示NHE6是一种新型胰岛素响应蛋白。稳定表达外部三重HA标签和 cytoplasmic C端GFP标记的NHE6的3T3-L1细胞，在未 permeabilization 情况下进行抗体标记。基础条件下，NHE6-GFP定位于细胞内，胰岛素存在下，细胞表面NHE6增加2.5倍。共聚焦显微镜图像的3D可视化显示，胰岛素处理后，一小部分NHE6变得与表面膜相关。

NHE6与GLUT4共定位

胰岛素信号传导的一个后果是选定的内体蛋白在细胞表面的胰岛素依赖性增加，最突出的是葡萄糖转运蛋白异构体4（GLUT4）。在基础状态下，NHE6-GFP和GLUT4-mCherry信号部分共定位（Pearson相关系数为0.32），胰岛素处理后共定位程度保持不变，表明共定位的细胞内NHE6-GFP和GLUT4-mCherry池 translocation 至质膜。

NHE6敲低减少胰岛素刺激的GLUT4表面 translocation

脂肪细胞中，基础表面表达 of Myc-GLUT4-mCherry在对照组和NHE6敲低细胞中均较低。胰岛素处理可诱导对照组细胞中cMyc-GLUT4-mCherry大量 translocation 至质膜，但NHE6敲低显著降低了GLUT4表面表达。二甲双胍（1 mM，24小时）处理的胰岛素非依赖性GLUT4 translocation 也减少，尽管程度较轻。二甲双胍并未增强胰岛素处理的NHE6敲低脂肪细胞中质膜GLUT4，表明GLUT4 translocation 通路存在共同破坏点。胰岛素还增强其他膜蛋白（如转铁蛋白受体，TfnR）的细胞表面 translocation。基础条件下，TfnR表面水平在NHE6敲低细胞中未显著降低，而胰岛素介导的增加仅在对照组细胞中观察到。这些发现表明NHE6在多种胰岛素响应蛋白的表面 translocation 中具有广泛需求。

NHE6敲低改变脂肪细胞中的葡萄糖摄取

NHE6敲低脂肪细胞中胰岛素响应性GLUT4 translocation 减少表明胰岛素信号转导通路的激活缺陷。丝氨酸/苏氨酸激酶Akt是胰岛素刺激GLUT4 translocation 的关键效应器。发现磷酸化Akt（p-Akt^Ser473）水平在胰岛素处理的NHE6敲低脂肪细胞中降低67%，而总Akt蛋白水平未变，表明该分支胰岛素信号通路激活受损。胰岛素响应性2-脱氧-d-[1,2-³H]葡萄糖（2-DG）摄取监测显示，对照组脂肪细胞中2-DG摄取急性胰岛素处理后增加七倍，而NHE6敲低脂肪细胞中仅增加两倍，与胰岛素响应信号传导和GLUT4表面表达减少一致。出乎意料的是，缺乏胰岛素时，基础2-DG摄取在NHE6敲低脂肪细胞中增加四倍。尽管GLUT4表面表达未变，这些观察表明其他葡萄糖摄取机制补偿性增加。可能机制涉及GLUT1葡萄糖转运蛋白的上调。尽管GLUT1的mRNA水平未变，但NHE6敲低脂肪细胞中GLUT1蛋白表达增加。因此，NHE6对胰岛素刺激的GLUT4表面运输具有选择性效应。其他葡萄糖转运蛋白如GLUT8和SGLT2也可能在NHE6缺失时上调，并贡献于3T3L1脂肪细胞中观察到的基础葡萄糖摄取。

NHE6调节脂肪细胞中的蛋白稳态

除胰岛素信号缺陷外，NHE6敲低导致的GLUT4表面表达急剧减少也可能是GLUT4表达减少的结果。显示NHE6敲低3T3-L1脂肪细胞基础条件下表达减少44%的GLUT4，尽管GLUT4转录本无显著变化。GLUT4存在于细胞内的离散细胞器池中，约40%位于内溶酶体系统中，表明NHE6调节GLUT4通过该池的行程。NHE6敲低脂肪细胞还显示胰岛素受体-β（IR-β）亚基蛋白水平减少30%，尽管转录水平增加24%。因此，GLUT4和IR-β蛋白减少是NHE6对GLUT4通路的转录后效应。评估GLUT4储存囊泡（GSV）的其他膜蛋白组分是否也显示响应NHE6敲低的蛋白表达改变。GSV的一个关键组分是sortilin，这是一种Vps10结构域包含蛋白，与内体腔内的GLUT4相互作用，并通过其 cytoplasmic 尾部招募回收体（GGA1）和网格蛋白组分。蛋白质组学分析显示低密度脂蛋白受体相关蛋白1（LRP1）是另一个主要的胰岛素响应组分。发现NHE6敲低降低了sortilin和LRP1的蛋白水平。脂肪积累需要通过胰岛素调节的脂肪酸转运蛋白（包括3T3L1脂肪细胞中的FATP1）摄取长链脂肪酸。显示FATP1蛋白水平在NHE6敲低脂肪细胞中降低，与BODIPY C₁₂脂肪酸摄取减少一致。总之，数据表明NHE6对脂肪细胞中胰岛素响应通路的多个组分施加蛋白稳态控制。

NHE6的化学旁路

NHE6的转运活性将腔内质子交换为阳离子，对抗V-ATP酶的质子泵活性以建立内体pH平衡。因此，NHE6缺失导致V-ATP酶使内体腔超酸化1-2个pH单位。在脂肪细胞中，NHE6敲低超酸化了内溶酶体区室，如吖啶橙荧光增加所示。V-ATP酶抑制剂巴弗洛霉素处理应废除H⁺泵送并碱化内溶酶体区室。这通过荧光点消失导致吖啶橙的扩散细胞质分布证明。蛋白质的溶酶体周转需要酸性区室pH。巴弗洛霉素处理将NHE6敲低脂肪细胞中的胰岛素受体和LRP1蛋白恢复至与对照组相似水平，如蛋白质印迹分析所示。离子载体莫能菌素是Na⁺/H⁺交换器的化学模拟物，并已显示阻断 cargo 的溶酶体递送并将蛋白质重新路由至细胞表面，有效逆转NHE6敲低在许多细胞类型中的效应。将莫能菌素加入NHE6敲低脂肪细胞足以将胰岛素受体IRβ和GLUT4蛋白恢复至与对照组相似水平。这些发现指出NHE6在调节胰岛素响应通路的蛋白稳态中的作用。

讨论

NHE6选择性调节胰岛素响应 cargo 的运输和周转

内体pH在调节质膜受体和转运蛋白的运输和周转中起关键作用。数据指出脂肪细胞胰岛素刺激葡萄糖和脂肪摄取的多个步骤受NHE6缺失影响。胰岛素信号通路激活减少，如Akt磷酸化减少所示，导致从胰岛素响应储存囊泡池中 cargo 的出胞作用和递送减少至质膜，降低葡萄糖和脂肪酸摄取。内体pH还通过调节腔内蛋白酶活性和间接影响运输至溶酶体直接影响蛋白质降解。NHE6缺失导致内溶酶体通路超酸化，增强了FATP1、GLUT4和GSV其他组分（如LRP1和sortilin）的降解。与内溶酶体pH的作用一致，GLUT4稳定性可通过已知缓解超酸区室pH的剂恢复，如莫能菌素（Na⁺/H⁺交换的化学模拟物）和巴弗洛霉素（H⁺-ATP酶抑制剂），指向 cargo 的溶酶体周转。注意，在先前工作中，已排除蛋白酶体在内体NHE介导蛋白质周转中的作用。NHE6敲低脂肪细胞中GLUT4表面表达的严重减少可能是胰岛素信号通路激活减少（由胰岛素受体表达减少和Akt磷酸化减少引起）和GLUT4蛋白降解增强的组合效应，尽管它们的相对贡献未知。有趣的是，NHE6似乎选择性靶向胰岛素响应通路，而GLUT1水平在NHE6缺失时增加，可能作为补偿。预计囊泡 cargo 对NHE6活性的蛋白稳态易感性可变，取决于共定位程度、其他pH调节器（如NHE9和PAC）的补偿效应以及蛋白质半衰期的个体差异。可能需要全面编目其周转可能受NHE6改变的蛋白质以更好理解选择性。

NHE6改变葡萄糖处理和糖原储存

胰岛素控制葡萄糖运输的失败是2型糖尿病胰岛素抵抗的主要组成部分。GLUT4基因变异罕见；因此，理解GLUT4蛋白稳态可能是代谢性疾病知识的关键。GLUT4表达在肥胖、前驱糖尿病、胰岛素抵抗和糖尿病个体中减少，并根据本研究结果可能受NHE6表达和活性影响。二甲双胍等双胍类药物广泛用于治疗糖尿病，部分通过增加脂肪组织中的葡萄糖摄取起作用。具体地，二甲双胍增加基础条件下脂肪细胞中胰岛素非依赖性质膜表达 of GLUT4。从蠕虫和苍蝇模型中的有趣发现显示eNHE突变体对二甲双胍耐药，可能通过自噬失调。观察显示二甲双胍并未恢复NHE6敲低脂肪细胞中GLUT4的表面表达。因此，与秀丽隐杆线虫中的观察相似，NHE6可能 required for 二甲双胍对哺乳动物GLUT4的 ameliorating 效应。识别影响GLUT4表达和运输的因素可能导致对糖尿病胰岛素抵抗的更好理解，这对更有效管理这种疾病至关重要。在小鼠模型中，GLUT4的杂合敲除和脂肪组织或骨骼肌中的条件性缺失导致胰岛素抵抗和发生糖尿病的倾向。有趣的是，脂肪特异性胰岛素受体敲除小鼠 exhibit increased lean body mass and protection from glucose intolerance。鉴于观察脂肪细胞NHE6敲低减少GLUT4和胰岛素受体丰度，在细胞水平上赋予胰岛素抵抗，全身NHE6敲除动物中的葡萄糖处理难以解释。Nhe6 null mice have lower body weight relative to control mice, but the same lean mass。由于小鼠按总体重给药，Nhe6敲除小鼠每瘦体重接受 effectively less glucose than WT mice。这可能掩盖葡萄糖不耐受，尤其在chow喂养小鼠中。缺乏对葡萄糖清除的明显效应也可能指向Nhe6^KO动物中GLUT4和胰岛素受体下调的相反表型，并可能需要组织特异性敲除和更仔细的葡萄糖和胰岛素耐量分析以澄清潜在机制。

对CS的启示

Nhe6^KO小鼠模型一直是理解NHE6缺失许多病理生理效应的有用工具。与患者相似，该模型显示神经退行性和神经发育特征的组合，包括延迟脑生长和浦肯野细胞丢失，改变的伤害感受器兴奋性和痛觉过敏。除关于骨骼异常的报告外，缺乏对非神经表型的研究，这些可能为CS病理学提供信息。在此背景下，关于Nhe6^KO小鼠中年龄依赖性脂肪积累缺陷的观察表型复制了与CS合并的年龄依赖性低身体质量指数，并为患者的胰岛素响应性、脂肪和葡萄糖处理中的潜在问题揭示了见解。部分，这些缺陷是细胞自主的，并且底层蛋白稳态失调可能贡献于较低脂肪积累。然而，葡萄糖或脂肪摄取的组织特异性失调（如骨骼肌或肠道中）也可能受NHE6调节，并值得进一步研究。另一个例子涉及CNS，其中GLUT4在活跃突触处 enriched to support energy demands during sustained activity。因此，一个有趣的问题是NHE6是否调节活跃突触处的葡萄糖摄取。

总之，本研究为未来NHE6在非神经系统中的生理研究提供了理由，符合内体Na⁺/H⁺交换的普遍组织分布和广泛功能作用。数据显示了将内体pH与脂肪细胞中葡萄糖和能量代谢联系起来的机制的可测试假设，为肥胖和糖尿病研究提供了新见解，并应刺激未来的额外研究。