综述：食品来源乳酸酸菌的抗氧化特性：一篇综述

本综述系统阐述了食品来源乳酸酸菌（LAB）的抗氧化机制与应用前景，详细解析了其清除自由基、螯合金属离子、产生抗氧化酶（如SOD、CAT）和代谢产物（如EPS、SCFAs）等多重作用途径，并评述了DPPH、ABTS、FRAP等主流体外抗氧化活性评估方法的优劣与实践策略，为开发天然抗氧化剂替代合成品提供了重要理论依据。

　　

摘要

乳酸酸菌（LAB）的抗氧化作用机制尚未得到完全阐明。本综述旨在表征从食品中分离的LAB菌株所呈现的抗氧化特性。文章系统阐述了抗氧化剂的定义与分类、LAB的抗氧化作用机制，探讨了最流行的抗氧化测定方法（包括每种测试背后的机理和抗氧化能力评估实践），并展示了具有抗氧化特性的食品来源LAB及发酵食品的研究实例。LAB是人类微生物群的重要组成部分，其在抗氧化过程中的作用极为关键。它们能通过增强抗氧化活性、螯合金属离子、产生抗氧化酶和其他代谢产物来快速有效地响应自由基，从而减轻氧化应激造成的损害。

1 引言

近年来，人们对自由基、生物系统中的氧化应激及其对人体生理学的影响日益关注。氧化应激是活性氧（ROS）的产生与机体清除它们的抗氧化能力之间的失衡。从生理学上讲，自由基是人体内自然发生的反应（如细胞呼吸或代谢过程）的副产物形成的。作为对ROS积累的自我防御，人体会产生自由基清除剂来防止或延迟细胞损伤。自由基是其外层轨道拥有一个或多个未配对电子的分子。通过与邻近分子的快速反应，未配对电子发生转移，导致进一步的自由基或ROS形成。

迄今为止，基于科学研究已证实，慢性氧化应激会加速衰老过程，并影响神经退行性疾病的发展，如阿尔茨海默病、帕金森病、肌萎缩侧索硬化症、唐氏综合症、心血管疾病、糖尿病、抑郁症、慢性肾病、代谢综合征和结肠癌。

为了对抗ROS的积累及其有害影响，生物体产生了一个复杂的抗氧化防御系统。抗氧化防线是一套保护这些微生物免受活性物种有害影响的机制。第一道抗氧化防御系统由抗氧化酶组成，如超氧化物歧化酶（SOD: Mn-SOD, Cu-SOD, EC-SOD）、过氧化氢酶（CAT）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）。第二道抗氧化防御由非酶抗氧化剂组成，如维生素C和E、类胡萝卜素、黄酮类化合物和低分子量硫醇化合物。其功能是清除自由基以防止氧化链式反应。第三道抗氧化防御是适应性和调节功能，由存在于细胞质和线粒体中的酶组成，它们通过多种氧化诱导酶系统（DNA修复酶、脂肪酶、蛋白酶、转移酶和甲硫氨酸亚砜还原酶）去除氧化的生物分子。它们的任务是识别、降解和清除被氧化应激修饰的蛋白质，并防止它们在细胞内积累。

理解适当的抗氧化作用机制以及预防氧化应激的新方法仍然是科学家们感兴趣的课题。由于ROS半衰期短，使用体内方法直接测量ROS难以进行。在体外维持恒定、受控的环境条件更容易。此外，体外研究应同时分析自由基中和和消化过程。这正是活体生物中发生的情况。氧化应激水平可以通过量化DNA损伤、膜过氧化和蛋白质修饰的水平来间接确定。微生物是植物的一个极好的生物活性物质来源，具有各种代谢活性。微生物的优点是在受控条件下培养且生长时间快。

开发新型微生物培养物的新方法涉及寻找具有特定特性的菌株。除了调节和改善肠道微生物组平衡之外，其他特性也是可取的，例如表现出抗氧化活性和对抗氧化应激。已经证明，食品，尤其是含有微生物（如乳酸酸菌）的发酵食品，可以在预防氧化过程中发挥重要作用。

1.1 抗氧化剂的分类

抗氧化剂是在低浓度下延迟或防止底物分子氧化的物质，导致自由基转化为非活性衍生物。抗氧化剂的历史始于防止不饱和脂肪变质的工艺。转折点是维生素E的鉴定及其在防止脂肪氧化中的作用。通过去除电子或氢，抗氧化剂可以通过直接与自由基反应来减少对细胞的氧化损伤。抗氧化剂作为自由基的清除剂。人们普遍认为，抗氧化化合物芳香环上羟基的位置和数量可能在抗氧化活性中起关键作用。

抗氧化剂可以内源性产生或外源性供应，如食品、营养保健品或膳食补充剂。它们可以根据不同的标准进行划分。抗氧化剂根据其作用方式、来源、大小、溶解度和结构进行分类。

抗氧化剂以不同的活性起作用并具有不同的作用机制。初级抗氧化剂通过中和自由基直接中断氧化链反应（例如在脂质氧化过程中）。这通常通过提供氢原子或电子来实现，从而中和自由基并将其转化为反应性较低的形式。次级抗氧化剂不直接抑制自由基反应。它们的功能是通过环境修饰来减慢或阻止反应的引发。它们的作用机制包括螯合过渡金属、降解脂质过氧化物、再生初级抗氧化剂以及创建阻碍氧气或促氧化剂进入底物的物理屏障。

根据抗氧化剂的来源，我们可以区分天然和合成抗氧化剂。天然抗氧化剂由生物体产生。它们可以中和体内过量的游离氧自由基。抗氧化剂的最佳来源是蔬菜、水果、草药和香料。天然抗氧化剂的质量和抗氧化活性取决于天然来源的质量、所使用的工艺和提取技术。合成抗氧化剂在自然界中不存在，通过化学合成生产。它们作为防腐剂添加到食品中以抑制脂质氧化。这些抗氧化剂也广泛用于制药工业，因为即使在低浓度下也具有高反应性、低成本和高纯度。它们比天然抗氧化剂更稳定。天然和合成抗氧化剂都必须满足无毒和安全的多重要求。

低分子量抗氧化剂（< 1000 Da）可以自由地在细胞和组织中扩散。它们存在于细胞质、细胞膜和体液中。它们直接中和ROS，主要是通过提供氢原子或电子。相比之下，高分子量抗氧化剂（> 10,000 Da）不能像小分子那样自由扩散。它们存在于特定的细胞结构中，如线粒体和细胞质。它们通过酶促去除活性氧和结合催化自由基形成的金属间接起作用。

脂溶性抗氧化剂主要存在于细胞膜中，而水溶性抗氧化剂则存在于细胞液中，如细胞质基质和胞质溶胶。

在另一种分类中，抗氧化剂可分为酶促和非酶促。酶促抗氧化剂分解并去除自由基，将其转化为过氧化氢。然后在辅因子存在下，通过过氧化氢酶逐步代谢为水和氧气。非酶促抗氧化剂的任务是抑制涉及自由基的反应。引入体内的外源性抗氧化剂已成为科学家关注的主题。同时，合成抗氧化剂的使用正在减少。

1.2 食品来源乳酸酸菌的抗氧化特性

乳酸酸菌是不需要氧气生长和代谢的微生物。然而，它们也可以在氧气存在下生长，这得益于基因表达的调节和代谢途径的变化。科学研究表明，一些LAB的好氧培养由于改善了内部pH稳态、增加了能量、合成了抗氧化酶和耗尽了细胞内O₂，从而提高了细胞强度。这有利于LAB在氧化应激条件下的存活。有趣的是，研究表明，在培养物中添加血红素和甲萘醌的情况下，LAB在有氧条件下培养可以在静止生长阶段增加生物量产量。这允许形成呼吸电子传递链，从而转化为细菌细胞对氧化应激抵抗力的增加。

已经确定了LAB防御氧化应激的几种机制。这些机制紧密相连并相互补充。

乳酸酸菌具有直接捕获某些类型自由基的能力，例如羟基自由基、超氧阴离子或过氧化氢。直接清除自由基包括通过细胞壁中包含的成分结合或限制其扩散。形成LAB细胞壁的这些大分子有助于在环境压力期间维持细胞完整性。表达某些表面成分和分泌特定化合物的能力是LAB的功能特征。肽聚糖、胞外多糖、磷壁酸和脂磷壁酸以及称为菌毛的蛋白质丝和蛋白质在这里的ROS清除中起主要作用。

过渡金属离子，特别是铁和铜离子，参与Fenton反应，产生自由基。在该反应中，Fe(II)催化过氧化氢转化为高反应性的羟基自由基。先前提到的LAB细胞壁结构能够螯合金属离子。这是通过将金属离子吸附在细菌表面来实现的，这限制了它们在环境中的可用性并减少了引发自由基反应的可能性。

第三种机制涉及广泛的锰积累以及抗氧化酶的产生，即超氧化物歧化酶、血红素依赖性和非血红素依赖性过氧化氢酶、NADH氧化酶、NADH过氧化物酶和谷胱甘肽还原酶。

抗氧化锰可以参与氧化还原反应，但与铁或铜不同，它不会产生羟基自由基。已经表明，许多LAB（例如，L. casei 和 L. paracasei）对锰积累有很高的需求，这与保护免受氧的毒性作用密切相关。细胞内锰的积累允许在有氧生长期间有效消除超氧阴离子。LAB必须严格调节Mn(II)稳态，以确保锰依赖性反应有足够的水平，但又足够低以防止其细胞毒性。这是通过控制输入器和输出器来实现的，由转录因子和氧化应激响应核糖开关介导。该过程由大量NRAMP型和ABC型锰转运蛋白系统促进。锰是锰超氧化物歧化酶（Mn-SOD）的辅因子。在缺乏经典SOD的LAB中，发现了高浓度的Mn(II)，它取代了SOD。积累锰的能力通常与缺乏真正的超氧化物歧化酶活性相关。

超氧化物歧化酶（SOD）是一种金属酶，可催化超氧阴离子自由基歧化为分子氧和过氧化氢，从而降低细胞内游离金属阳离子的浓度并减轻H₂O₂造成的损害。已经描述了四种类型的超氧化物歧化酶，它们的不同之处在于活性位点中存在的金属原子：含铁（Fe-SOD）、含锰（Mn-SOD）、含铜/锌（Cu/Zn-SOD）和含镍（Ni-SOD）。在LAB中最常观察到的超氧化物歧化酶是MnSOD，而FeSOD和Cu/ZnSOD则少见得多。已经表明，Mn-SOD活性取决于锰的细胞内浓度，如前所述。

过氧化氢酶（CAT）是氧化还原酶组中的一种酶，可催化过氧化氢分解为水和氧气。有两种类型的过氧化氢酶：真正的血红素依赖性过氧化氢酶和假过氧化氢酶，其结构中含有锰。一般来说，LAB是过氧化氢酶阴性的，实际上不产生过氧化氢酶。在一些LAB中，真正的过氧化氢酶仅在培养介质中存在血红素或羟高铁血红素时才会出现。假过氧化氢酶在LAB中相当少见，但一些LAB如L. plantarum可以产生假过氧化氢酶。

最常见的是，LAB抗氧化系统基于NADH氧化酶和NADH过氧化物酶的作用。NADH氧化酶利用积累的氧气将NADH氧化为NAD⁺，这会导致过氧化氢量增加。反过来，产生的过氧化氢被NADH过氧化物酶分解为H₂O。这相同的过氧化氢也具有抗菌功能，但对LAB本身有毒，因此会从周围环境中快速去除。

硫氧还蛋白还原酶（TrxR）是一种含硒酶，一种黄素酶，它使用辅因子NADPH参与硫氧还蛋白的氧化。TrxR与硒原子形成复合物，借此它调节整个硫氧还蛋白系统并调节体内硒的量。它在还原过程中发挥作用，有助于抗氧化细胞的防御、蛋白质还原和核酸生物合成。硫氧还蛋白基因的表达水平对与氧化应激相关的各种疾病状态的发展有特定影响。例如，在L. casei中，trxB基因负责硫氧还蛋白还原酶，并且硫氧还蛋白-硫氧还蛋白还原酶系统是其有氧条件下生长所必需的。

由于LAB实际上持续暴露于氧化应激，它们已经发展出遗传决定的抗氧化机制。这些机制的基础是编码抗氧化酶的基因的表达。在LAB中发现的主要基因是sodA，最常编码Mn-SOD；katA, katB，编码过氧化氢酶；npr, ahpC, ahpF，编码过氧化物酶；gshR，编码谷胱甘肽还原酶；和gor，编码谷胱甘肽氧化还原酶。

在氧化应激条件下，抗氧化酶被激活，这使得LAB能够抵抗氧化刺激。LAB的抗氧化活性也与谷胱甘肽、胞外多糖（EPS）和短链脂肪酸（SCFAs）的产生有关。

谷胱甘肽（GSH）是一种非蛋白质硫醇，存在于几乎所有生物体中。它通过保护细胞免受自由基和稳定细胞内环境中的氧化还原而在应对氧化应激中发挥作用。GSH再生其他抗氧化剂，例如维生素C和E，保持蛋白质中的-SH基团处于还原状态，并参与外源物质的解毒。体内充足且稳定的谷胱甘肽量不允许过氧化氢积累，否则会导致细胞损伤。

胞外多糖是长链大分子生物聚合物，通过具有α或β结构的糖苷键连接，由细胞分泌到外部。根据化学成分，它们分为同多糖（HoPS）和杂多糖（HePS）。大多数LAB可以或多或少地产生EPS，并且由于LAB具有GRAS status（一般认为安全），源自它们的EPS通常也被认为是安全的。已经表明，源自LAB的EPS可以清除自由基DPPH或羟基自由基。

短链脂肪酸是碳水化合物和膳食纤维发酵的副产物。LAB最常产生的是乙酸、丙酸和丁酸。SCFAs可以直接中和活性氧，有助于减少氧化应激。丁酸特别重要的特性是影响负责产生抗氧化酶的基因的激活。它还对细胞中的各种信号和表观遗传途径有特殊影响。

正如前一章所介绍的，LAB已经发展了各种复杂和多方面的抗氧化作用机制。LAB的抗氧化能力与其在宿主胃肠道中的活性密切相关。LAB抗氧化活性的变化表明它们是菌株依赖性的，这为选择具有特定实施和健康促进潜力的细菌提供了可能性，如下一章所述。

1.3 乳酸酸菌抗氧化活性的测量方法

有必要区分两个经常被混淆为相同的定义。第一个是抗氧化活性与抗氧化剂淬灭反应分子作用的动力学有关。它表示为反应速率或单位时间的清除百分比。另一个定义是抗氧化能力，它是抗氧化剂转化反应分子的热力学效率。这是在给定时间内被1摩尔抗氧化剂清除的反应分子的摩尔数。“抗氧化活性”的定义描述了给定测试中单一化合物的特性。大多数测试基于产生合成的有色自由基或氧化还原活性化合物，并在不同波长下分光光度监测它们的变化。抗氧化能力被确定为抑制百分比或使用适当的标准。根据Huang等人的说法，“抗氧化能力”可互换地称为“效率”、“功率”、“参数”、“潜力”、“效力”或“活性”。今天我们知道这些术语并不总是意味着同一件事。由于抗氧化活性被定义为反映特定条件下化学反应的单一测试，将其定义为“总抗氧化活性”是错误的。

测量抗氧化活性方法的一个特点是特别是无法相互比较方法。这是由于每个测试的特异性：自由基的类型、产生自由基的不同系统或作用机制。抗氧化能力取决于要清除的生成自由基，因此必须始终确定并仔细选择。抗氧化测定可以针对单一的特定化合物或针对总抗氧化能力，即样品中所有抗氧化化合物的综合能力。对于生物样品，抗氧化能力比抗氧化活性更能代表抗氧化状态。常用的抗氧化标准包括抗坏血酸、丁基化羟基甲苯（BHT）、α-生育酚、丁基化羟基茴香醚（BHA）、没食子酸和Trolox（6-羟基-2,5,7,8-四甲基色满-2-羧酸）。

第一批测量抗氧化剂的方法是基于脂质氧化的测量。随着时间的推移，这些方法得到了改进。测试的灵敏度和过程的自动化程度提高了。抗氧化活性的研究是一个非常复杂的过程，单一方法无法完全描述发生的反应。这对于体内研究尤其如此。此外，最好选择不同的测试方法，即使是那些彼此之间没有严格相关的方法。这将允许更好地理解在抗氧化效应中起关键作用的机制。

一个仍然存在的问题是难以解决的事实，即没有单一、经过验证和通用的方法来检查食品和生物基质的抗氧化活性。这些方法的另一个问题是缺乏测试进行的标准化和程序。体外研究没有考虑许多生物参数。然而，由于体内研究通常涉及伦理问题以及高成本，体外测试在科学中的重要性被强调。正如Danet所强调的，体外抗氧化测试和总酚含量的测定用于评估潜在的有益抗氧化效果，以及用于食品质量控制，其中样品可以与参考材料进行比较。它们的应用非常广泛。方法选择不当可能导致反应混合物中的干扰，从而导致结果低估或高估。正如Gulcin和Alwasel所强调的，抗氧化活性应始终通过至少三种不同的方法测量。

有多种方法可以对测量抗氧化活性的方法进行分类。一个例子是基于发生的化学反应进行划分。

氢原子转移（HAT）反应涉及测量抗氧化剂通过提供氢原子来去除自由基的能力。这些通常是快速反应，持续几秒或几分钟，并且不太依赖于pH和溶剂。例子包括ORAC（氧自由基吸收能力）、HORAC（羟基自由基抗氧化能力）、TRAP（总过氧自由基捕获抗氧化参数）和TOSC（总氧自由基清除能力）测试。

单电子转移（SET）反应基于检测抗氧化剂转移电子以还原金属离子、羰基和自由基的能力。它们是相当慢的反应并且取决于pH值。此类反应的例子是F-C测试（Folin–Ciocalteu测试）、FRAP（铁还原抗氧化能力）和CUPRAC（铜离子还原抗氧化能力）。

混合HAT/SET测定涉及氢原子和单电子两者的转移。例子包括DPPH（2,2-二苯基-1-苦基肼）测定和ABTS（2,2′-联氮双-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)）测定。一些研究人员将这些类型的测定仅分为HAT和SET，而不指出混合测定。

基于HAT和SET的方法最常用于测定抗氧化能力，而涉及ROS清除的其他方法也需要设计。Huang等人指出，人体内的氧化损伤主要由六种主要的活性氧引起。损伤主要由超氧阴离子（O₂^?-）、过氧化氢（H₂O₂）、过氧自由基（ROO^?）、羟基自由基（HO^?）、单线态氧（¹O₂）和过氧亚硝酸盐（ONOO^?）引起。使用ROS的测定可用于全面评估抗氧化能力。通常，这些测试包括一种氧化剂。

这些方法通常基于抗氧化剂和模型自由基之间的简单化学反应。ABTS和DPPH测试最常用于研究。由于其简单性、低成本、不需要专门设备以及能够同时分析多个样品，这些测试已成为抗氧化活性分析的基础。同时，Dudonne等人的研究证明，DPPH和ABTS测试与Folin–Ciocalteu方法的结果 strongly correlated。FRAP方法与总酚含量之间也观察到很强的相关性。这两个后续测试通常与ABTS和DPPH结合使用。

如前所述，我们建议使用至少三种不同的方法来测试LAB筛选的抗氧化活性。理想情况下，这些测试应代表不同的抗氧化作用机制。通过使用多种研究方法，可以获得更完整和可靠的抗氧化活性图像。

1.4 乳酸酸菌抗氧化特性的筛选

细菌筛选涉及选择和鉴定具有所需、特定生物或技术特征的细菌菌株。根据Zhou等人的说法，大多数使用自由基清除的方法可以成功地用于评估LAB的抗氧化活性。完整细胞、无细胞上清液、无细胞提取物、细胞裂解物和发酵后代谢物均可用于研究。LAB产生的酶和非酶代谢物，如超氧化物歧化酶、谷胱甘肽还原酶和谷胱甘肽，主要存在于CFS部分中。近年来，关于乳酸酸菌及其严格抗氧化特性的出版物显著增加。

发酵是提高食品产品抗氧化活性的有效方法。在文献中，我们可以找到有效提高发酵食品抗氧化活性的LAB菌株的例子，如肉和肉制品、乳制品、肉和奶替代品、蔬菜、水果、饮料、谷物产品和豆制品。

Luan等人检查了L. plantarum CD101的抗氧化活性以及细菌对发酵香肠中生物活性肽形成的影响。发现该菌株的体外抗氧化活性存在于细胞表面和细胞外分泌物中。分析方法鉴定了在发酵香肠中有效抑制氧化酸败的肽。

Xu等人的研究显示了L. helveticus 1.0612对切达干酪在成熟过程中抗氧化谱的积极影响。该研究旨在鉴定切达干酪制造过程中产生的抗氧化肽。添加L. helveticus 1.0612对切达干酪中抗氧化肽的释放产生了有益影响。

研究了添加LAB对骆驼奶抗氧化能力的影响。使用经典发酵剂培养物（作为对照）以及L. helveticus、L. casei、L. paracasei和L. rhamnosus菌株进行牛奶发酵。含有Lactobacillus细菌的牛奶显示出更高的DPPH自由基清除活性。此外，在整个储存期间，含有L. helveticus菌株的牛奶显示出更高的总酚含量和FRAP。

基于腰果奶的酸奶在用Lactobacillus菌株发酵后，总酚和类黄酮含量以及总抗氧化能力增加。L. rhamnosus、L. casei和L. plantarum可以成功地用于生产腰果酸奶作为抗氧化剂的来源。

蔬菜也可以用细菌富集从而增强抗氧化活性。红卷心菜用L. plantarum ATCC 8014和L. acidophilus NCFM发酵。与未发酵的卷心菜相比，发酵提高了抗氧化活性，通过DPPH和TEAC测量。还注意到总酚含量略有增加，通过Folin–Ciocalteu方法测定。

对由L. plantarum发酵的猕猴桃的研究表明，酚类化合物和类黄酮的含量负责增加的DPPH和ABTS清除能力。此外，发酵本身对这种水果的酚类谱产生了积极影响。

Wang等人证明，用L. plantarum发酵谷物增加了提取物中酚类化合物和类黄酮的含量。谷物发酵物显示出更强的DPPH自由基清除和铁还原活性。证明了在巨噬细胞中抑制LPS诱导的细胞内ROS产生而没有细胞毒性作用。

在Li等人的研究中，枣汁是在添加LAB菌株的情况下生产的。用细菌发酵枣汁显著增加了总酚含量，通过Folin–Ciocalteu方法测量。此外，发酵汁显示出最高的DPPH自由基清除能力和更高的铁还原抗氧化能力。LAB发酵显著改善了抗氧化能力，并且与咖啡酸和芦丁的含量呈正相关。

豆制品也可以富含抗氧化价值。在王等人的研究中，豆奶由L. plantarum、L. acidophilus、L. casei、L. bulgaricus和L. helveticus发酵。溶剂提取物测试了DPPH和ABTS自由基清除以及FRAP测定。所选菌株比未发酵的豆奶获得了更好的抗氧化能力。

LAB的抗氧化潜力是全球科学家关注的焦点。这与人们对微生物在功能性食品生产中的作用以及微生物组对人类健康的重要性的日益增长的兴趣有关。

2 结论

用于食品生产的LAB的抗氧化活性，如益生菌特性，是菌株依赖性的。这种特异性意味着不同的菌株可能表现出不同的抗氧化活性，这直接影响它们的潜在用途。因此，为了选择最适合用于功能性食品生产的菌株，使用了筛选测试。筛选旨在分离具有最强特性的菌株，在这种情况下是抗氧化特性。在选择最佳方法时，必须考虑许多因素，从分析条件到底物类型、抗氧化剂类型和被测基质。

一个问题是没有单一的参考方法用于确定细菌及其所含食品的抗氧化特性。使用一种测试方法不能反映总 real 抗氧化能力。这意味着由于抗氧化剂具有不同的作用机制，因此使用不止一种测试进行测试非常重要。理解抗氧化作用机制允许精确规划给定菌株的使用。可以说，这种研究方法是全面的，因为它既可以用于食品保鲜，也可以用于治疗干预。

LAB是人类和动物微生物群中不可或缺的元素，也是发酵食品的组成部分。毫无疑问，这些微生物的一些有益特性源于它们的抗氧化特性。已知LAB的几种抗氧化作用机制。最近的科学研究显示了使用LAB菌株作为胃肠道的保护成分以减少氧化应激的负面影响以及增强宿主整体抗氧化状态的前景。然而，应该注意的是，抗氧化防御机制必须完全阐明。在这项研究中，还提请注意需要进一步研究以更好地理解作用机制并在精心设计的临床试验中确认健康促进效果。