机械可调骨支架：3D打印磷酸钙/聚己内酯墨水在体内硬化的突破及其成骨潜力

本综述重点介绍了一种创新的3D打印自硬化α-TCP/PCL（α-磷酸三钙/聚己内酯）复合骨支架。该支架在打印后呈现高韧性、可钻孔和螺钉固定的特性，植入体内后在生理条件下发生相变（α-TCP水解为CDHA，即钙缺陷羟基磷灰石），实现原位硬化，力学性能（如抗压强度和弹性模量）提升至接近人体松质骨水平。研究通过系统的体外实验（包括细胞活性、ALP活性、炎症因子表达等）和兔股骨髁及皮下植入模型，证实该材料不仅具有良好的生物相容性、骨诱导性及免疫调节潜力（如下调促炎细胞因子TNF、IL1B、IL6），还能支持新生骨长入、成熟及支架降解，展现出优异的骨再生能力，为承重部位骨缺损的个性化修复提供了新材料策略。

　　

引言

钙磷酸盐（CaPs）3D打印技术的出现彻底改变了定制化骨移植物的制造方式。该技术允许根据患者个体需求精确设计和制造移植物，有助于与天然骨结构的无缝整合，并提高愈合和功能恢复的成功率。尽管取得了重大进展，但3D打印CaP支架固有的脆性仍然限制其在承重解剖部位的应用。例如，颅颌面重建通常承受中等负荷条件，这使其成为这些材料临床转化的更现实目标。在这种情况下，对几何形状复杂、患者特异性支架的需求进一步支持了3D打印的潜力。然而，引入互连孔隙度（这对血管化和骨传导至关重要）不可避免地会损害机械强度。支架必须承受生理负荷，不仅是为了保持解剖稳定性，还要防止体内碎裂，因为碎裂可能导致颗粒碎片的释放和随后的炎症反应，从而损害组织再生。此外，确保可靠的机械固定仍然是一个重大挑战。传统方法涉及压配或使用螺钉、钢板或钉子，在植入过程中存在诱导支架断裂的显著风险，破坏即时结构稳定性和长期再生结果。

在这项研究中，提出了一种新颖的方法，基于设计一种能够随时间演变的3D打印支架，其机械特性能够响应体内环境而变化。其理念是从一种在刚打印时具有延展性和韧性的支架开始，该支架在植入体内后经历相变，导致其硬化。从临床角度来看，刚打印的支架的初始延展性非常具有吸引力，因为它将提供最佳的可操作性、可固定性，并能良好地贴合骨缺损，确保与宿主骨的最佳接触。响应生理条件的自硬化能力将提供强度和弹性模量的增加，接近骨的机械性能。

这一想法建立在早期研究的基础上，在该研究中，通过将反应性α-TCP（α-磷酸三钙，Ca₃(PO₄)₂）颗粒加入无水的PCL（聚己内酯）溶液中作为粘结剂，开发了一种用于直接墨水书写（DIW）的自硬化墨水。聚合物的存在，即使量很少，也提供了支架的即时可操作性，这些支架表现出高延展性和韧性。此外， upon water immersion, the α-TCP/PCL scaffolds underwent a phase transformation through the hydrolysis of α-TCP into calcium-deficient hydroxyapatite (CDHA, Ca₉(PO₄)₅(HPO₄)(OH))，这逐渐加强了材料。因此，硬化后的CDHA/PCL支架表现出显著增强的强度和韧性，明显优于纯CDHA。

假设是这种相变，负责支架的硬化，也可能在生理条件下发生，从而提供拥有体内硬化支架的可能性。然而，这由于几个原因非常具有挑战性。首先，支架不含水，因此硬化反应必须完全依赖于从生理液体中水扩散到α-TCP/PCL基质中，而PCL是一种疏水性聚合物。这与直接浸入水中的情况非常不同。其次，细胞外液中存在的离子和蛋白质，其中一些对羟基磷灰石沉淀具有抑制作用，可能会阻碍CDHA的形成，而CDHA是硬化过程的基础。最后，有必要了解这种反应在体内发生可能如何影响材料的生物相容性、细胞反应和成骨潜力。

因此，本研究的目标是双重的。首先，旨在研究α-TCP/PCL 3D打印支架的体内硬化能力。其次，旨在深入分析体内硬化反应以及PCL的存在如何影响新工程支架的生物相容性和成骨特性，并与预硬化的CDHA/PCL和纯CDHA支架进行比较。为了解决这些目标，在多个层面上研究了支架与生物环境的相互作用，包括暴露于生物液体、体外细胞反应和体内性能。这些分析包括评估自硬化行为、支持新骨形成的能力以及再生组织的结构和生物学表征。最后，为了增强研究结果的转化相关性，通过在两个实验组中在雌性和雄性兔子中重复植入，考虑了潜在的性别特异性生物反应，从而能够更全面地评估跨性别的材料性能。

结果

支架在生理液体中的处理和演变

本研究的最初假设之一是，刚打印的α-TCP/PCL复合支架将改善手术过程中的处理，从而有助于固定，例如通过螺钉。为了验证这一假设，进行了可螺钉性测试，包括使用钻头创建一个通孔，然后拧入外科螺钉。结果表明，虽然两种支架都能承受使用1.2 mm钻头的初始钻孔，但陶瓷支架（CDHA）在螺钉插入过程中由于牵引力而断裂。相比之下，刚打印的α-TCP/PCL支架成功地耐受钻孔和螺钉放置而無失效。

将3D打印的CDHA、CDHA/PCL和α-TCP/PCL支架在完全DMEM中孵育8天，旨在模拟体液。通过XRD应用Rietveld精修确定了孵育期间相组成的变化。结果显示，虽然CDHA和CDHA/PCL支架保持恒定组成，主要包含CDHA（94-95%），但α-TCP/PCL支架经历了渐进转变，通过α-TCP水解为CDHA，从初始组成的86% α-TCP和8% CDHA转变为8天后的18% α-TCP和80% CDHA，证明α-TCP水解发生，并且没有被培养液中存在的离子、蛋白质和其他生物分子所阻碍。然而，衍射峰的轮廓更宽且不太明确，显示与在其他两组中存在的CDHA相比，在α-TCP/PCL支架中形成的CDHA结晶度较低。

这与通过SEM观察到的不同支架的微观结构一致。在细胞培养液中8天后的表面微观结构显示，CDHA和CDHA/PCL支架（已经预水解）显示出相似的微观结构，由针状纳米级CDHA晶体组成，并且与原始微观结构相比没有检测到变化。相比之下，α-TCP/PCL支架的表面粗糙得多，具有可识别的α-TCP颗粒形态。在浸泡期间，α-TCP颗粒的初始光滑表面被CDHA的小晶体覆盖，这是水解过程的结果。值得注意的是，在含PCL的支架表面没有观察到聚合物的存在。通过显示横截面微观结构随在细胞培养液中浸泡时间的演变，说明了α-TCP/PCL支架中发生的微观结构转变。观察到α-TCP颗粒的逐渐溶解，伴随着针状CDHA晶体的沉淀，存在于PCL纤维中，形成陶瓷/聚合物基质。相比之下，由较大CDHA晶体组成的其他组的微观结构在培养液浸泡期间保持不变。

测定了支架从培养液中吸附的蛋白质数量。含PCL的支架在初始时间点表现出较低的蛋白质吸附，在第二天更为明显。然而，4天后，蛋白质吸附的差异不再具有统计学意义。

在离子交换方面，ICP分析表明，在α-TCP/PCL支架的情况下发生的水解反应没有显著改变细胞培养液的离子组成，就Ca²⁺和磷酸盐（Pi）而言。所有支架在最初24小时内从培养液中吸收Ca²⁺，浓度减少约一半，并且这种吸收在整个研究期间持续，支架类型之间没有显著差异。至于Pi，记录到CDHA支架在最初24小时内释放，浓度翻倍，但随后逐渐减少，8天后恢复到初始水平。相比之下，CDHA/PCL和α-TCP/PCL支架在研究期间没有显著改变培养液的Pi浓度。

体外研究

成骨细胞反应

评估了直接接种在支架上的成骨细胞样MG-63细胞系的活力和形态。LIVE/DEAD测定表明从第3天到第7天在任何条件下都没有细胞死亡；然而，与CDHA和CDHA/PCL支架相比，α-TCP/PCL支架中的细胞形态和密度受到影响，而CDHA和CDHA/PCL支架彼此没有差异。分别标记细胞核和F-肌动蛋白的DAPI/Phalloidin染色显示，7天后在CDHA和CDHA/PCL支架上的细胞呈现铺展形态，而在α-TCP/PCL支架上的细胞显示较少铺展或圆形形态。

使用SEM进一步分析了细胞与支架拓扑结构的相互作用。从第1天开始，MG-63细胞在CDHA和CDHA/PCL支架上显示出粘附丝（白色箭头）。相比之下，α-TCP/PCL支架上此类粘附丝的存在较少。

随后，通过测量代谢活性，在间接和直接测定中评估了细胞增殖。间接评估显示，暴露于CDHA/PCL和α-TCP/PCL条件培养基的细胞与对照相比，增殖没有显著差异。然而，对于CDHA条件培养基观察到增殖显著减少。在直接测定中，所有在3D支架上培养的细胞都表现出比对照显著更低的增殖率，对照在7天内达到高达18.2 ± 0.5倍的值，而所有支架显示的值低于10倍。关于支架特异性增殖，CDHA和CDHA/PCL支架显示出相似的趋势，而α-TCP/PCL支架表现出增殖显著减少，值分别为8.25 ± 1.35、7.46 ± 1.15和4.38 ± 1.18倍。来自LIVE/DEAD图像的细胞覆盖面积的量化进一步证实了α-TCP/PCL支架中的显著减少。

通过测量ALP活性和成骨基因表达评估了支架的成骨特性。与对照相比，所有支架在3天和7天时诱导ALP活性增加。在接种在α-TCP/PCL支架上的细胞与那些在CDHA和CDHA/PCL支架上的细胞之间观察到轻微差异。此外，成骨标记物ALPL、SPP1和RUNX2的基因表达水平在CDHA和CDHA/PCL支架上培养3天后显著高于对照，但在α-TCP/PCL支架上则不然。然而，这些标记物的表达在所有支架类型培养7天后都增加了。

体外炎症反应

使用巨噬细胞样RAW246.7细胞系评估了免疫反应。LIVE/DEAD成像显示没有细胞死亡，并揭示了在支架丝上存在活细胞簇，三种类型的支架之间没有可辨别的差异。DAPI/Phalloidin染色显示，在第7天观察到的簇由单个巨噬细胞组成，没有细胞融合。SEM成像提供了对巨噬细胞形态的进一步见解，显示在所有支架类型中，从第1天的圆形细胞转变为第7天的具有伪足的扁平伸长细胞。

代谢活性测量显示，在间接细胞培养中，RAW246.7增殖在任何条件下与对照相比没有显著差异。相比之下，当细胞直接培养在三种支架类型上时，从第3天到第7天观察到与对照相比增殖显著减少，但支架类型之间没有显著差异。

通过RT-PCR分析了直接培养在支架上的细胞中促炎细胞因子TNF、IL1B和IL6的基因表达，揭示了每个基因的差异调节。在第3天，与对照相比，所有支架类型中TNF均上调。IL1B在CDHA和CDHA/PCL支架中上调，而IL6在CDHA/PCL和α-TCP/PCL支架中下调。在第7天，TNF上调减少，仅在CDHA/PCL支架中保持轻微上调。IL1B表达在所有条件下下降，与对照相比没有显著差异。IL6在所有支架类型中强烈下调。

通过使用检测40个靶点的蛋白质阵列测定进一步评估了直接在支架上培养7天的RAW246.7细胞的炎症反应。其中，检测到13种蛋白质，包括与M2表型相关的IL-4、MCSF和MCP-1，以及与M1表型相关的XCL1、CCL1、CX3CL1、CXCL6、IL-12 p70、MIP-1γ、MIP-1α、GCSF、TNF RI和TNF RII。结果显示，与对照相比，所有支架类型中IL-4轻微上调，而MCSF在CDHA和α-TCP/PCL中上调，MCP-1在CDHA/PCL中上调。XCL1和CCL1在CDHA/PCL支架中上调，XCL1在α-TCP/PCL中也增加。值得注意的是，MIP-1α、GCSF、TNF RI和TNF RII在CDHA/PCL和α-TCP/PCL支架中强烈下调，而在CDHA支架中，仅MIP-1γ、MIP-1α和TNF RI下调。

体内性能

使用兔股骨髁中的标准化圆柱形缺陷（5 mm直径）评估体内性能，这是一个适合评估骨替代材料的关键尺寸部位。该模型允许评估早期机械稳定性、骨传导性和骨-材料相互作用。为了在没有天然骨干扰的情况下分离矿物相变，将额外的植入物皮下放置。包括两个对照组：1）完全陶瓷CDHA支架，作为阳性对照，因其众所周知的骨传导和成骨特性；2）预硬化CDHA/PCL支架，其组成与测试材料相同，但在植入前进行了硬化反应。这允许比较体内硬化和预硬化状态，提供关于体内反应的可行性、其生物相容性及其对支架性能的影响的见解。

手术顺利。然而，12周组中的两只动物没有从手术中完全恢复，最终在手术后两周被处死，这导致四个样本的损失，对应于CDHA（雌性）、CDHA/PCL（雌性）、CDHA（雄性）和CDHA/PCL（雄性）。其余动物完成了正常的术后期间，没有任何临床并发症。在术后期间未观察到感染迹象、伤口裂开、体重减轻、行为变化、植入物迁移或跛行。此外，4周组中的两只动物在植入期间丢失了皮下植入物，分别对应于CDHA和CDHA/PCL。

支架在体内的演变

对皮下植入4周的支架进行了评估，并与未植入的支架（0周）进行比较，以评估其机械特性的演变，特别是评估α-TCP/PCL支架在体内设置中的反应。通过SEM检查了横切支架的微观结构。CDHA和CDHA/PCL支架的微观结构在植入4周后未改变，由纠缠的CDHA纳米晶体网络组成，CDHA/PCL还显示PCL纤维。相比之下，α-TCP/PCL支架表现出完全的微观结构转变，从嵌入PCL纤维中的单个光滑颗粒转变为互连的CDHA晶体，类似于在CDHA/PCL支架中观察到的。

在压缩中评估了支架的机械特性。CDHA支架在植入4周后显示抗压强度没有显著差异。相比之下，CDHA/PCL支架在4周后表现出抗压强度减少。然而，最显著的变化是在α-TCP/PCL支架中观察到，其表现出机械行为的非常显著变化，从植入前的非常延展性行为低强度转变为类似于植入4周的CDHA/PCL支架的机械性能，导致弹性模量和抗压强度增加5倍。有趣的是，抗压强度和应变能密度（与支架的韧性相关）都优于纯陶瓷CDHA支架2.5倍和3倍。这些结果与作为硬化反应结果的局部机械特性演变非常一致，如通过纳米压痕评估的。

观察到的微观结构和机械特性的变化与材料中存在的相的演变很好地相关，如通过XRD鉴定的。在CDHA和CDHA/PCL支架中，在4周植入期间未观察到组成变化，CDHA是主要相。相比之下，α-TCP/PCL支架在体内经历了几乎完全的转变，从α-TCP到CDHA，在植入4周时达到96% CDHA。还值得提到的是，在CDHA/PCL支架中，观察到峰值定义减少，表明结晶度损失，并与观察到的机械特性减少相容。

还对植入骨中的样本进行了XRD分析。在这种情况下，无法区分来自支架中羟基磷灰石的信号与来自骨矿物相的信号（这也是羟基磷灰石）。因此，相量化不可行。然而，α-TCP衍射峰的消失表明水解反应也完成了。

通过微计算机断层扫描（μ-CT）和SEM分析骨形成

通过μ-CT在三个维度上量化了骨形成。圆柱形感兴趣区域（ROI）的体积重建和支架/骨分割显示，在4周时，再生骨覆盖了支架表面，但观察到在支架孔隙度中的渗透有限。在12周时，在雌性和雄性动物中的所有组中都发现了更大的表面覆盖和宏观孔隙度渗透。分段μ-CT图像的体积量化显示，在植入4周后，不同组之间新形成骨的数量没有显著差异。在12周时，在含PCL组中检测到显著增加，达到比纯CDHA支架更高的值。在两个进行植入的组中，雌性和雄性动物之间的比较显示没有显著差异，尽管在雄性动物中有更大骨量的趋势。

移植物的SEM横截面证实了μ-CT观察结果，显示在4周时支架横截面中的新骨形成少于12周时。通过SEM图像的骨面积测量证实了这一趋势，在雄性动物的CDHA和两性的CDHA/PCL中，从4周到12周有显著增加。在任何时间点或12周时性别之间，未观察到支架类型之间的统计学显著差异。

骨质量评估

使用拉曼光谱和纳米压痕分别评估了新形成骨在支架内的组成和机械特性，并与天然小梁骨进行比较。进行拉曼光谱以分析在不同时间点再生骨的矿物与基质比率。959 cm^?1处的磷酸盐带指示矿物相。至于有机相，它可以通过胶原中存在的某些特定氨基酸带表征，如L-脯氨酸（854 cm^?1）或L-苯丙氨酸（1002 cm^?1）。平均光谱显示。

这些带之间的比率提供了关于矿物与基质比率的信息，这与新形成骨的矿化程度相关。在雌性兔子中，新形成骨的磷酸盐/L-苯丙氨酸比率显著低于小梁骨在4周时，但在12周时在所有支架中增加，当时与宿主骨没有发现统计学显著差异。相比之下，在植入雄性动物的组中观察到值显著低于小梁骨。尽管趋势相似，但当使用磷酸盐/L-脯氨酸比率计算时，新形成骨和宿主小梁骨之间的差异较小。所有组在4周时显示出比小梁骨更低的矿物与基质比率，并且在雌性兔子中12周时，在小梁骨与CDHA/PCL和α-TCP/PCL组之间没有发现显著差异，并且在雄性动物中CDHA和CDHA/PCL组之间也没有。

纳米压痕结果与观察到的矿化趋势一致。在4周时新形成骨的弹性模量显著低于宿主骨。尽管在所有组中随着植入时间增加，但在雌性动物的CDHA和α-TCP/PCL中，在12周时记录的值仍然显著低于宿主小梁骨的值，仅对于α-TCP/PCL达到相似的值。在12周时在雄性动物中记录的弹性模量与雌性对应物相似，并且小于宿主骨。在所有组中也观察到硬度随植入时间增加，在所有情况下获得的值都低于小梁骨，无论是雌性还是雄性动物。力-位移曲线说明了与宿主小梁骨相比，新形成骨在不同时间点的机械特性的演变。

组织学评估

使用苏木精和伊红染色来识别一般组织结构和细胞类型。低放大倍数图像（比例尺=2 mm）显示在植入后4周没有异物反应或纤维组织 encapsulation，允许骨渗透与支架表面接触。此外，在周围骨髓中观察到炎症迹象，其特征在于单核细胞增加。在中放大倍数（比例尺=500 μm）和更高放大倍数图像（比例尺=100 μm）上更详细地，新骨向内生长沿着支架的宏观孔隙度明显，骨直接形成在支架丝上在所有组中。发现活跃的成骨细胞（蓝色箭头）围绕新骨和在支架上。观察到新骨髓的渗透，在新形成的血管中可见红细胞组（红色箭头）。

在植入后12周，低放大倍数图像显示在所有条件下周围骨髓中单核细胞减少。新骨区域比4周时更大，并且成骨细胞仍然存在，形成新骨化点或围绕新骨。有趣的是，一些支架丝出现降解，为骨 colonization 创造空间（绿色箭头）。对每种条件的成骨细胞数量进行了量化，未观察到统计学显著差异。

使用TRAP染色来识别破骨细胞的存在。在植入后4周，在所有支架类型中检测到破骨细胞，由红色箭头指示。值得注意的是，它们中的大多数与支架丝表面接触。到植入后12周，观察到类似的模式；然而，破骨细胞数量增加，围绕破骨细胞的更大TRAP信号区域明显。值得注意的是，具有显著支架降解和骨渗透的区域显示出更强烈的TRAP信号。可用区域中TRAP信号的量化显示。

使用甲苯胺蓝和马森三色染色分别确定类骨质的形成和表征新骨中胶原的存在。甲苯胺蓝图像显示在4周时支架内存在类骨质，与宿主小梁骨不同，显示异染性。有趣的是，在12周时异染性水平显著降低，与从类骨质到成熟骨的渐进成熟一致。此外，通过马森三色染色在所有样本中观察到结构良好的胶原纤维。

为了更好地理解细胞外基质的演变，进行了天狼星红和阿新蓝-高碘酸雪夫（AB-PAS）染色。天狼星红允许根据其分子量区分胶原：使用偏振光，低分子量（LMW）胶原，对应于新形成的胶原纤维，呈现红橙色，而更成熟的高分子量（HMW）胶原呈现绿黄色。在4周时，再生骨中主要存在LMW胶原，而HMW信号在12周时清晰可见。偏振光信号的量化显示，在植入4周时再生骨中LMW胶原的比例在88%和90%之间，在12周时显著减少，在70%和73%之间。这些值显著高于天然小梁骨呈现的值（在28%和35%之间），并且未发现支架组成或性别之间的统计学显著差异。

使用阿新蓝（AB）和高碘酸雪夫（PAS）染色分别对蛋白聚糖、粘蛋白和糖蛋白进行了分析。这种双重染色方法揭示了在所有样本中新形成骨中存在AB阳性区域。这些AB阳性区域在植入后4周时在再生骨中更为突出，并且它们的浓度在12周时显著减少。相比之下，天然小梁骨显示最小的AB染色。在相同植入时间点，未检测到支架类型之间或雄性和雌性受试者之间的显著差异。未揭示任何样本的PAS染色可检测信号。

骨再生标记物的免疫组织化学

通过免疫组织化学（IHC）确定了骨再生相关标记物骨钙素（OC）、骨桥蛋白（OPN）和CD34的表达。在植入4周时发现OC表达低，与天然小梁骨相比，但信号在12周时在所有组中增加，无论是在骨中还是在支架丝表面。相比之下，与宿主小梁骨相比，在4周时观察到高OPN信号，在12周时减少，回到基线。类似于OC，OPN信号在支架表面强烈，在12周时的值显著高于4周时。另一方面，CD34信号位于骨髓中，并显示出与OPN相似的趋势，在4周时高信号，高于天然骨，在12周时减少，尽管在这个时间点仍然显示高于天然骨髓的水平。此外，在再生骨髓中观察到脂肪细胞减少存在和高ECM密度。对于任何标记，未发现支架组之间或性别之间的统计学显著差异。

讨论

各种材料，包括陶瓷、聚合物和金属，已被探索用于骨再生，每种都提供 distinct 优势和局限性。金属，如钛及其合金，提供优异的机械强度和负荷承载能力，但 largely 生物惰性，可能需要表面修饰以增强骨整合。聚合物，无论是天然还是合成，提供可调降解速率和灵活性，但它们通常缺乏内在生物活性和骨传导性。相比之下，陶瓷，特别是钙磷酸盐，因其 exceptional 生物活性和成骨潜力而脱颖而出，紧密模仿天然骨的矿物相。然而，它们的临床应用受到其不良机械特性的阻碍。宏观多孔陶瓷支架固有脆性，可能无法承受生理负荷以维持解剖稳定性和避免碎裂，这可能引发炎症反应并阻碍再生。此外，实现安全机械固定仍然有问题，因为传统方法在植入过程中存在诱导支架断裂的显著风险，从而危及初始结构稳定性和长期愈合。

在这项工作中，首次证明了开发3D打印钙磷酸盐基支架的可能性，该支架可以在植入体内后硬化。这代表了一个范式转变，因为它允许在支架具有延展行为和高韧性时植入，并等待其机械强度在体内增加，从而使其能够承受增加的机械负荷。实际上，与纯CDHA支架不同，刚打印的复合α-TCP/PCL支架表现出良好的处理特性，并耐受用于支架固定的关键过程，包括钻孔和螺钉拧入。这种增强的性能直接归因于刚打印支架的高韧性，如先前研究中报道的，其中测量了3.5 KJ/m³的弯曲应变能密度，大约比CDHA支架大十二倍。固定程序使得植入物能够安全放置在临床部位，这对于确保在整个再生过程中的稳定性和与宿主骨的最佳接触至关重要。体内硬化能力由当支架暴露于生理液体时α-TCP向CDHA的转变触发。值得注意的是，已经证明这种体内硬化能力不会损害仿生羟基磷灰石既定的生物相容性和成骨特性。

与用于骨缺损治疗的传统CaP基配方（如颗粒、可塑腻子和可注射骨水泥）相比，本文开发的支架结合了 superior 结构和机械稳定性与互连宏观孔隙度和通过3D打印进行患者特异性制造的能力。与传统通过高温烧结生产的3D打印生物陶瓷支架不同，开发的材料在生理条件下硬化。这种低温硬化过程不仅允许可调机械特性和增强韧性，而且允许在制造过程中直接掺入生物活性剂，包括药物、生长因子和先进有机治疗剂，为组织再生提供了一个多功能平台。此外，与大多数CaP-聚合物复合材料相比，这些支架的高陶瓷含量确保了生物活性相的直接暴露，从而最大化其治疗效果。

通过一系列体外实验和动物研究，分析了体内硬化α-TCP/PCL支架的生物学性能，并将其与预先反应的CDHA/PCL支架和完全无机的CDHA支架进行了比较。除了分析体内硬化反应可能对再生过程产生的影响外，还旨在评估PCL的存在对材料成骨能力的影响。

3D打印的α-TCP/PCL支架证明了在模拟与体液相互作用的细胞培养条件下反应和转变为CDHA的能力。然而，尽管在培养液（DMEM）中水解没有受阻，但观察到结晶度和晶体形态和尺寸的变化，导致更小的晶体，特别是在暴露于培养液的α-TCP颗粒表面，这可能与蛋白质吸附的相互作用有关。在皮下植入设置中进一步证实了与体液接触的反应能力，达到几乎完全的转变，与CDHA和CDHA/PCL支架相同水平。皮下植入是为了避免骨长入，这可能会干扰通过XRD检测支架中CDHA的形成和机械特性的表征。尽管无法避免软组织的渗透，但结果表明其对测量的影响最小，并且可能与所有组中支架破裂后应力下降的缓解有关。

值得注意的是，体内反应伴随着导致支架硬化的微观结构演变。值得注意的是，植入四周后，α-TCP/PCL支架的弹性模量从≈20 MPa增加到140 MPa，抗压强度从≈2 MPa增加到12 MPa，达到超过无机CDHA支架抗压强度的两倍。这些值落在报道的天然小梁骨范围内，通常弹性模量为100-500 MPa，抗压强度为2-12 MPa。值得注意的是，拥有与松质骨相当而不是更高的弹性模量是有利的，因为它有助于正确的负荷传递，并有助于防止应力屏蔽效应。这种植入后机械性能的改善表明支架实现了适用于负荷共享骨再生应用的特性。在这些情况下，支架不需要支持整个生理负荷，