模拟中脑与脑桥黑质色素金属结合特性及其在帕金森病与阿尔茨海默病MRI对比成像中的机制研究

本综述系统阐述了合成神经黑素（NM）类似物与铁、铜的结合特性及其对质子弛豫（PRE）的调控机制，通过多模态技术（ICP-OES/XAS/EPR/MRI）证实单核顺磁性位点与金属簇共存状态，揭示了NM敏感MRI（NM-MRI）对比度变化的分子基础，为神经退行性疾病（如帕金森病PD/阿尔茨海默病AD）的早期影像学生物标记开发提供关键理论支撑。

　　

Graphical Abstract

合成神经黑素（Neuromelanin, NM）类似物用于表征铁与铜在黑色素组分或结合蛋白（β-乳球蛋白, βLG）上的结合特性。模型证实了单核顺磁性结合位点以及铁或混合金属簇的存在，这些结构以不同强度增强水质子弛豫。研究结果有助于深入理解因神经退行性病变导致的脑内NM含量改变所引起的MRI对比度变化。

Abstract

神经黑素（NM）是一种深色色素，能结合潜在毒性金属离子，对神经元脆弱性至关重要。磁共振成像（MRI）被提议用于测量黑质（substantia nigra, SN）或蓝斑核（locus coeruleus, LC）中的NM，可能作为帕金森病（PD）的生物标记。本研究制备了含铁和铜的合成NM类似物，用于表征金属结合及其对质子弛豫的影响，这是优化NM敏感MRI的前提条件。结果证实了顺磁性单核Fe(III)和反铁磁性耦合簇的存在，它们以不同程度增强弛豫。Cu(II)的引入增加了复杂性，它可竞争单核位点结合、聚集形成混合金属簇或结合于黑色素相关的蛋白质。与强弛豫剂Fe(III)不同，Cu(II)仅通过取代铁间接影响弛豫。总体而言，MRI主要提供平均NM浓度的测量结果，而通过多参数MRI可能获得不同金属组成NM的分布信息。

Introduction

神经黑素（NM）是一种存在于中枢神经系统的深色不溶性色素，尤其多见于黑质（SN）的多巴胺能神经元和蓝斑核（LC）的去甲肾上腺素能神经元。随着年龄增长，这两个脑区的NM浓度大致呈线性增加。NM是有效的金属离子螯合剂，尤其对铁、铜和锌具有高亲和力。由于其能结合大量潜在毒性金属离子，NM被认为具有保护作用。铁是最丰富的金属，从SN分离的NM中铁含量高达11 μg/mg，而LC的NM结合铁较少但铜较多。NM也被认为是神经元脆弱性的关键因素，特别是在铁饱和或由退化神经元（如PD或AD中）释放时。尸检研究显示，PD患者的NM水平低于同年龄健康对照的50%。

MRI允许在体评估组织成分。过去十年中，所谓的NM敏感MRI（NM-MRI）作为神经退行性疾病的生物标记日益受到关注。NM因其顺磁性而加速水质子弛豫，这可能是NM-MRI中T₁加权对比度的主要来源，并可通过NM富集区域附近的磁化转移效应进一步增强。或者，有效横向弛豫率（R₂^*）和MRI基于的磁强计显示与多巴胺能神经元内积累的铁相关，可能提供PD的早期标记。

NM成像因SN（约5 mm厚）和LC（直径2–3 mm）的尺寸小而具有挑战性。除金属外，人NM色素还包含黑色素、脂质和蛋白质成分，它们全部包裹在特定的神经元内细胞器中，使得组成和结构研究困难。黑色素组分包括不溶性深棕至黑色真黑素（eumelanin, Eu）和碱溶性黄至红褐色褐黑素（pheomelanin, Pheo），后者硫含量较高。Pheo被认为形成内部核心，外围被Eu包围，Eu/Pheo比例可达约3:1。蛋白质共价结合，贡献约10%的色素质量，部分表征显示其具有纤维状淀粉样交叉-β结构。黑色素组分具有稳定的自由基，与金属相互作用。若干研究强调了人NM中两个不同的铁结合位点具有不同亲和力，共同特征是Fe(III)被黑色素组分中的儿茶酚氧供体螯合。基于电子顺磁共振（EPR）结果，菱形高自旋Fe(III)中心被分配给具有低至中等金属亲和力的单核位点，可能结合额外水或羟基层。大多数铁可能通过儿茶酚基团以高亲和力结合在多核簇中，通过氧和/或羟桥耦合。

NM与水的相互作用对于优化NM-MRI采集和理解结果至关重要。这需要关于结合位点和金属类型对弛豫影响的信息，而这在体内不易获得。人NM研究困难，因为仅能从脑部提取少量。合成类似物可在明确条件下制备和修改，有助于填补这一空白。然而，由于人NM的复杂性和未知结构方面，模拟人NM具有挑战性。只有少数MRI研究使用合成黑色素，专注于磁化转移。

与早期研究相比，当前工作检验了更现实的人NM模型，其中除了黑色素，还包含β-乳球蛋白（βLG）作为β结构蛋白质组分以及铁和铜。关于金属离子分布对MRI参数的调节知之甚少。因此，结合了多种模态，包括电感耦合等离子体光学发射光谱（ICP-OES）、X射线吸收光谱（XAS）、核磁共振（NMR）、电子顺磁共振（EPR）和基于MRI的弛豫测量与磁化率测量。总体目标是更好地理解与神经退行性疾病相关的金属积累和/或NM损失如何影响MRI对比度，以助开发在症状出现前检测疾病的敏感方法。

Results and Discussion

表征共轭物组成

黑色素-βLG共轭物的NMR谱显示，芳香区域（6.0–7.5 ppm）包含一个几乎无特征的包络，涵盖黑色素组分和蛋白质残基的信号。随着Cu/Fe或Fe/Cu比例的增加，精细结构部分定义，这可能与黑色素组分构象流动性增加相关。在1.0–1.5 ppm（βLG残基的脂肪族侧链）也发现变化，显示一个宽信号，随着Cu/Fe比例增加分裂为两个组分。过量铁超过铜的样品谱未显示可识别趋势，需要进一步审视。比较显示，从SN组织分离的人NM的NMR谱与合成模型有相似之处。

黑色素部分与βLG共价结合，防止了预期位点的蛋白水解。因此，合成共轭物中蛋白水解后缺失的肽片段可能包含DA醌的结合位点，并与黑色素低聚物共价连接。在当前共轭物中，His146似乎是βLG的主要DA醌结合位点，因为Cys66和Cys106参与二硫桥，而Cys121在天然蛋白质中不可及。

EPR测量

在10 K记录的EPR谱中三个主要特征明显：i) 自由基的尖峰（g因子2.0，在无金属样品中），部分被g≈2.15的强Cu(II)共振掩盖；ii) Cu(II)信号的超精细分裂；iii) 具有菱形对称和大零场分裂的高自旋Fe(III)信号，g=4.3，与人NM相同。两种信号振幅随温度升高（60 K和室温）而降低，这符合居里-韦斯顺磁性，这在合成神经黑素和冻干脑组织中均有演示。室温测量显示另一个非常宽的铁信号在g=2.1，聚集在反铁磁域中，在10 K不可检测，这与人铁蛋白中结果相似。

Fe(III)信号在10 K显示最小线形变化，允许从峰值振幅估计相对Fe(III)量。Cu(II)线形变化更大，与组成依赖性超精细参数报告一致，可能表明混合氧/氮配位。这些变化在过量铜样品中特别明显，表明分布在多位点，至少低铜负载时结合到蛋白质。EPR结果显示，只有一小部分铁在黑色素制剂中是顺磁性的，这与研究表明在混合Cu/Fe衍生物中EPR活性Fe(III)分数低于5%一致，而仅含铁的样品值稍高。大多数铁因此聚集在具有反铁磁耦合的簇中（即有效电子自旋S减少），与人NM相似。减少的EPR活性Cu(II)分数（在混合Cu/Fe衍生物中9%–52%）也被先前发现，我们的结果证实了这一点。

图1中的相关性表明，Fe(III)和Cu(II)可以在PheoβLG-CuFe中结合到相同的单核位点。竞争吸附模型与s_Fe对a_Fe/a_Cu的依赖关系一致证实了这一假设。值得注意的是，拟合参数c₀和c₂表明两种离子具有相似的结合亲和力。

在EuβLG-CuFe中，似乎至少有一个额外的EPR活性Cu(II)结合位点，在低a_Fe时优先（且独立于Fe）占据。对于较高a_Cu但相对低a_Fe，s_Cu的变化类似于PheoβLG-CuFe中的行为。尽管组合数据可以拟合到非竞争模型，但这一结果意义有限，因为单一结合位点似乎不覆盖EuβLG-CuFe中的整个Cu浓度范围。虽然铁预计仅结合到黑色素部分，但铜也可以结合到蛋白质。由于合成NM与