基于光栅耦合干涉技术（GCI）的合成寡甘露糖苷与伴刀豆球蛋白A（ConA）亲和力筛选研究揭示糖缀合物多价效应与构效关系

本综述系统介绍了光栅耦合干涉技术（GCI）在糖缀合物与凝集素相互作用研究中的创新应用。作者通过酶促合成策略构建了结构明确的甘露糖寡糖（Mono-/Di-/Tri-saccharides）并偶联至载体蛋白（RNase A/HSA），首次采用GCI技术定量分析了多价糖缀合物与模型凝集素ConA的亲和力（Kd达纳摩尔级），揭示了糖链长度（Man(α1,2)Man > Man(α1,6)Man）、连接方式及多价效应对结合强度的显著影响，为靶向C型凝集素受体（如MR/CD206）的糖疫苗设计提供了新思路。

　　

引言

碳水化合物-蛋白质相互作用在生理与病理过程中具有重要作用，其中甘露糖化靶向策略可特异性识别抗原呈递细胞表面的甘露糖结合C型凝集素受体（如MR/CD206、DC-SIGN/CD209等）。尽管天然复杂聚糖（如Man₉GlcNAc₂）被视为金标准配体，但其获取困难且结构异质性强。研究表明，简化糖链（如二糖、三糖）在溶液中的亲和力受限于微摩尔级浓度及自由取向，而多价展示可显著增强结合能力。伴刀豆球蛋白A（ConA）作为经典植物凝集素模型，其依赖金属离子（Ca²⁺/Mg²⁺）的糖识别机制与哺乳动物C型凝集素高度相似，因此被选为本研究的模型受体。

传统表面等离子体共振（SPR）技术虽广泛用于糖-凝集素互作研究，但新兴光栅耦合干涉技术（GCI）凭借其全样本检测特性，展现出更高灵敏度与信噪比。本研究团队前期开发了基于乙酰基单保护策略的化学酶法合成技术，可高效制备含硫氰甲基的甘露糖寡糖，并通过异头位氨基甲酸乙酯（IME）活化实现与蛋白质的定点偶联。本研究首次将GCI技术应用于系统评价结构明确的寡甘露糖苷-蛋白缀合物与ConA的相互作用，旨在揭示糖链长度、连接方式及多价展示对亲和力的影响规律。

结果与讨论

2.1 IME糖苷及新糖蛋白的合成

通过酶促区域选择性脱乙酰化（ Candida rugosa 脂肪酶）获得C6/C2位修饰的甘露糖砌块，与三氯乙酰亚胺酯（TCA）活化供体缩合，高效合成了Man(α1,6)Man（化合物5）、Man(α1,2)Man（化合物6）及新型三糖Man(α1,2)Man(α1,6)Man（化合物10）。所有糖苷均以乙酰基为唯一保护基，经甲醇钠处理后转化为IME活化形式（1-IME、5-IME、6-IME、10-IME），并通过赖氨酸偶联与核糖核酸酶A（RNase A）和人血清白蛋白（HSA）缀合。质谱分析表明，RNase A缀合物的平均糖负载量为5.7–7.9 mol/mol，HSA缀合物为15.3–23.5 mol/mol，形成结构明确但负载数异质的新糖蛋白库。

2.2 GCI方法开发

ConA通过胺偶联化学固定于4PCH多羧酸盐芯片表面（pH 4.5）， immobilization yield达8237 ± 889 pg/mm²。以甲基-α-D-甘露糖苷（Me-Man）为参照，GCI测得其Kd为92 ± 11 μM，与SPR文献值一致，验证了芯片活性。天然糖蛋白RNase B（含Man_5-9GlcNAc₂）的GCI分析显示纳摩尔级亲和力（Kd = 44 ± 6 nM），需采用50 mM Me-Man进行芯片再生以维持ConA稳定性。最终确立的分析条件为：流速10 μL/min，结合/解离时间180 s，浓度范围2–312 nM，交替使用50 mM Me-Man与300 mM Me-Man/1 M NaCl再生序列。

2.3 新糖蛋白的GCI亲和力测定

GCI分析揭示所有新糖蛋白均呈现纳摩尔级高亲和力（Kd = 4–45 nM）。单糖-RNase A缀合物（Kd = 45 ± 6 nM）与天然RNase B亲和力相当，证明多价效应（负载5.7 mol/mol）可补偿糖链复杂性缺失。二糖比较显示，Man(α1,2)Man缀合物（Kd = 16 nM for RNase A; 7.4 nM for HSA）显著优于Man(α1,6)Man（Kd = 22 nM for RNase A; 40 nM for HSA），且该差异在糖负载量相近的RNase A缀合物中更为凸显，表明α1,2连接方式本身具有更高结合优势。三糖Man(α1,2)Man(α1,6)Man展现出最强亲和力（Kd ≈ 4 nM），证实糖链延伸可进一步增效。未缀合蛋白无结合活性，证明亲和力完全源于糖模块。

2.4 与其他研究的对比

本研究GCI数据与SPR、糖芯片文献值高度一致（见表2）。多价展示使简单糖链的亲和力提升至纳摩尔级，与糖聚合物、糖树枝状大分子及天然糖蛋白相当。值得注意的是，本研究合成的二/三糖缀合物亲和力甚至优于某些天然Man₉缀合系统，表明在多价背景下，糖链精细结构（如α1,2连接）与展示方式比糖链复杂度更具决定意义。

结论

本研究成功建立GCI技术用于糖缀合物-凝集素互作的高通量分析平台。通过系统比较发现，Man(α1,2)Man motif比Man(α1,6)Man具有更强结合力，而三糖Man(α1,2)Man(α1,6)Man可进一步增效。多价展示使简单糖链获得与复杂天然糖蛋白相当的纳摩尔级亲和力，证明“价态与展示方式”而非“糖链复杂度”是驱动亲和力提升的核心因素。该工作为靶向C型凝集素受体的糖疫苗设计提供了结构优化新策略。

材料与方法

化学试剂与ConA、RNase A/B、HSA购自Sigma-Aldrich等供应商。糖苷合成采用乙酰基单保护策略，酶促脱保护与TCA活化缩合为主要步骤。IME活化糖苷与蛋白在pH 9.5硼酸钠缓冲液中偶联，超滤纯化后经HILIC-UV-MS/MALDI-ToF定量糖负载量，RP-LC-UV定量蛋白浓度。GCI使用Creoptix WAVE系统，ConA胺偶联固定于4PCH芯片，分析条件为10 mM HEPES（pH 7.4）、150 mM NaCl、1 mM CaCl₂/MgCl₂、0.05% Tween 20，数据采用1:1模型拟合。