海洋痕量金属形态分析新突破：自动化伏安系统实现样品体积大幅缩减与效率提升

本综述系统介绍了一种创新的自动化伏安分析系统，通过定制化测量池和微型参比电极实现了样品体积的大幅缩减（最低至1 mL），并成功整合自动化样品处理功能。该系统在保证测量质量的前提下，将铜浓度测量所需体积降低70%（至3 mL），络合研究降低78%（至28.5 mL），同时减少分析师工作量达89%。其模块化设计支持多种测量程序，特别适用于样品量受限的海洋孔隙水等环境，为痕量金属形态研究提供了突破性技术方案。

　　

引言：海洋痕量金属研究的重要性与技术挑战

痕量金属在海洋生物地球化学系统中扮演着关键角色，既作为海洋生物的微量营养素或毒素，也作为多种地球化学过程的示踪剂。铁（Fe）、锌（Zn）、镍（Ni）等金属可限制浮游植物生长，而铜（Cu）、铬（Cr）、镉（Cd）等则可能对海洋浮游生物产生毒性效应。值得注意的是，痕量金属的生物效应不仅取决于其溶解浓度，更受其与有机金属结合配体络合作用的控制。有机络合物已被证明能增强Fe、Zn、Cu的生物可利用性，并在高浓度时降低毒性。

为了深入理解这些过程，需要高灵敏度、高特异性的分析方法来测量海洋环境中极低的痕量金属浓度（约10^?13?10^?7 mol/L）及其氧化还原形态和有机络合状态。伏安法因其对特定氧化态自由金属离子的特异性以及在盐水基质中的高灵敏度，成为许多已建立方法的基石。

伏安法在痕量金属分析中的优势

伏安法对痕量金属分析可达10^?10至10^?9 mol/L的灵敏度，对铂（Pt）和碲（Te）等新兴污染物的检测甚至可达10^?14 mol/L，这些元素通过质谱法测量尤其困难。此外，伏安法固有地适用于测定溶解痕量金属的氧化还原形态，因为通常只有特定的氧化还原物种会在特定的还原或氧化电位下反应。

与质谱测量相比，伏安法的仪器和试剂成本较低，但在同时分析大样本集中的多种元素时不具竞争力。其在海水中的 specialized 分析方面具有显著优势，因为盐分干扰许多其他方法，但有利于伏安分析作为电解质。伏安法特别是测量金属结合有机络合物浓度和结合强度的少数成熟方法之一，这对于理解影响这些痕量金属的运输过程及其生物可利用性至关重要。

伏安痕量金属分析所需的样品体积

使用悬汞滴电极（HMDE）设置的痕量金属分析通常需要10 mL的测量体积。虽然这对大多数单个样品测量来说不是一个显著的限制因素，但对海洋研究中有机痕量金属络合测量可能是一个主要问题。一个典型的有机配体测量由15个等分样品组成，因此需要150 mL的总样品体积。由于这些样品需要在分析前在-20°C下冷冻保存，从海上考察到实验室的样品运输对于较大的样本集可能变得非常昂贵。

此外，对于海洋沉积物研究而言，如此体积的孔隙水样品非常难以获得。沉积地球化学过程在海洋有机质处理中起着关键作用，相应地也在沉积物-水界面处产生结合痕量金属的有机配体。沉积物已被确定为铜结合配体的主要来源，控制着向海洋的铜通量，研究发现在沿海和河口沉积孔隙水中以及太平洋深海中都有显著的铜结合配体产生。然而，由于可用样品体积的限制，孔隙水中有机金属络合的伏安研究仍然很少，样本量非常小，限制了水平和垂直分辨率。

虽然已经开发了多种用于更小样品体积（甚至低至微升范围）的伏安测量系统，但其中大多数依赖于与HMDE不同的电极配置。尽管由于汞的高毒性对健康和环境的关注，无汞电极的开发取得了巨大进步，但HMDE目前仍然是海洋痕量金属研究的标准，因为其具有卓越的灵敏度和重现性。

Monticelli等人使用定制石英池将HMDE工作电极的样品体积减少了20倍至0.5 mL（最近报道该方法使用1 mL测量体积）。虽然这是一项重大的分析成就，但该系统迄今尚未被广泛采用，这可能归因于定制石英部件制造的困难以及使用此类池进行测量所需的精细处理。目前，市场上没有可用于使用HMDE以小于10 mL样品体积测量海水的系统。

测量时间和自动化

伏安浓度测量的标准添加通常通过使用各种不同的加药设备实现自动化，这些设备通常采用高精度注射泵在测量过程中逐步向样品中添加标准溶液。然而，在许多电分析实验室中，将样品转入和转出测量池仍然是一个手动过程。这使得分析师必须在场进行样品更换，这对于需要每个样品通常15个等分样品进行样品更换的有机配体测量来说是一个特别重要的因素。

这将分析限制在仪器操作员的工作时间内，并产生显著的人员成本，可能抵消伏安测量仪器和试剂成本相对较低的优势。根据每个样品的等分样品数量和测量参数，这限制了有机形态分析每天只能进行2-3个样品，需要一名全职分析师。样品转移自动化是大多数类型化学分析中的常见程序。它将分析师的工作限制在样品制备和仪器维护上，从而大幅减少所需的工作时间。此外，它将可用分析时间扩展到分析师的工作时间之外，以增加每天可以分析的样品数量。

实验部分：创新系统的构建与验证

本研究展示了一种测量体积为1 mL的自动化伏安系统，代表所需样品体积减少了10倍，或者在考虑准确、全自动样品转移所需的额外体积时，减少7倍至1.4 mL。该系统通过相对简单且可逆地改造常用市售伏安系统而设置，组件可由大多数大学车间或商业制造服务制造，并且可以在制造商软件内控制，无需额外程序。

试剂与材料

所有试剂均使用Sartorius水纯化系统产生的超纯水（>18.2 MΩ）制备。使用盐酸（HCl, ROTIPURANUltra 34%）和氨溶液（ROTIPURANUltra 20%）进行pH调节。

铜浓度和络合测量试剂包括：使用硼酸（H₃BO₃, Sigma–Aldrich, 99.999% trace metals basis）和氢氧化钠一水合物（NaOH*H₂O, Supelco, 99.99% Suprapur）制备的1 mol/kg硼酸盐缓冲液，用于在测量期间将样品pH稳定在8.2；作为络合试剂的水杨醛肟（SA, Sigma–Aldrich）；用于浓度测量的50 mmol/kg和100 mmol/kg HCl储备溶液；用于络合测量的0.5 mmol/kg溶液；以及用于铜浓度标准添加的100 ppm元素标准溶液（Inorganic Ventures）稀释至0.25 μmol/kg超纯水中。用于铜络合滴定的10 ppm标准溶液稀释至4和0.4 μmol/kg。SA储备溶液在5°C下储存，每月制备一次，而移液溶液每次测量新鲜制备。

所有样品和试剂容器在使用前都经过清洗程序：首先使用洗碗机用反渗透纯化水和neodisher（Dr. Weigert GmbH）碱性洗涤剂进行初步清洗；然后用2% v/v硝酸（HNO₃, technical grade）和0.2% v/v氢氟酸（HF, technical grade）溶液填充容器，在40°C下直立保持24小时，倒置再保持24小时；之后，用超纯水冲洗三次，填充1 mol/L HCl（ROTIPURANSupra）并在40°C下每侧再保持24小时；酸清洗后，用超纯水冲洗三次，然后填充超纯水并在室温下每侧保持24小时以完全去除酸；最后，再次冲洗三次，双层袋装储存直至使用。浓度测量样品储存在低密度聚乙烯（LDPE）瓶中，形态测量样品储存在氟化高密度聚乙烯（HDPE）瓶中。用于紫外消解的样品转移到全氟烷氧基烷烃（PFA）或氟化乙烯丙烯（FEP）瓶中。

为控制测量稳定性，使用来自印度洋的大量表层水样品（SO301-44-1500m）的等分样品作为内标包含在每个测量运行中。此外，使用认证参考物质（CRMs）的浓度测量来验证测量的准确性。根据研究的样本集，分别使用NASS-7、CASS-6或SLRS-6（加拿大国家研究委员会）用于开阔海洋、沿海海洋和河流样品。

伏安测量的体积缩减

所有测量均使用Metrohm Autolab PGSTAT204恒电位仪连接Metrohm Autolab 663 VA站进行。测量使用Metrohm NOVA软件控制。

电极设置采用HMDE（Metrohm MMEpro）作为工作电极（WE），采用三电极配置，包括玻璃碳对电极（CE）和银/氯化银/3 mol/L氯化钾（KCl）参比电极（Ag/AgCl/3M KCl RE）。为适应更小测量池以进行更小样品体积的测量，通过打磨上端将CE缩短了2-3 mm，并用定制制造的更小RE替换了伏安系统中常用的相对较大的双盐桥RE。

微型RE的构造类似于Luther等人描述的方法，使用0.125英寸PEEK管（可作为HPLC压力管市售）。将一段直径2 mm的银线（Alfa Aesar, 99.999%）焊接到屏蔽电缆的铜线上，并将其插入PEEK管中。然后用环氧树脂密封管子，并在电极电缆上添加一个4 mm香蕉插头。通过在稀释KCl溶液中以9 V极化10-15秒，在电极表面形成氯化银层。为创建单接界盐桥，使用多孔玻璃滤板（Gamry Instruments），用PTFE热缩管将其连接到RE上，并用3 M KCl溶液填充由此产生的空腔。多孔玻璃滤板的泄漏率低，减少了本文报道的定量测量中参考电位的漂移。玻璃滤板每周更换一次，并通过在HCl（0.5 M）中浸泡几天进行再生。为确保参比电极的良好性能，AgCl涂层至少每月去除和补充一次。通过连续测量48小时，对这种参比电极设计与Metrohm传统双盐桥设计的稳定性进行了测试，测试样品为经紫外消解的海水，添加了30 nM Cu，使用20 mM硼酸盐缓冲液和100 μM SA，pH 8.2。为用于Metrohm Autolab 663 VA站，创建了一个3D打印适配器，该适配器围绕电极体并将其固定在原来较大RE的位置。最后，通过打磨和抛光减小了PTFE搅拌器的直径和长度，并缩短了用于惰性气体鼓泡的入口管以适应更小的测量池。

为找到小体积测量容器的最佳尺寸，3D打印了一系列具有不同尺寸的原型，选择了最合适的模型，并用PTFE制造以替换原来的10 mL FEP容器。发现1.5 mL是可靠保证测量质量的最低测量体积，而在更小体积下，气泡偶尔会中断电极连接。本文提出的测量容器的CAD设计文件见附录S1（支持信息）。

测量自动化

所有样品在分析前在10 mL FEP小瓶或4.5 mL PFA小瓶中制备，并使用CETAC ASX260自动进样器通过PTFE管连接到测量站，通过Gilson Minipuls 3蠕动泵。相同的蠕动泵用于在测量完成后将样品转移到废液容器中。流量由带有Cheminert接头的VICI阀控制，进口和出口分别配有定制在线电导传感器。

电导传感器由两片镀金线构成，以20 mm间距插入1 mm内径的PTFE管中，用环氧树脂密封，并在电压分压电路中与10 MΩ参考电阻连接。电导传感器和蠕动泵通过Arduino Nano微控制器的模拟输入和输出控制，而自动进样器和阀门直接通过UART串行连接控制。通过使用C#编写的.NET框架自定义命令库，将自动化设置的控制集成到NOVA软件程序中。

有机络合自动测量

使用本文提出的系统通过CLE-AdCSV测量铜的有机络合时，样品缓冲至pH 8.2，并与5或10 μmol/kg SA的检测窗以及0–100 nmol/kg Cu的递增添加在15–18个单独的2 mL体积PFA小瓶中平衡过夜（>12小时）。由于所需的平衡时间和使用单独的等分样品，标准添加不是自动进行，而是提前使用可调微升移液器手动进行。平衡后，然后使用上述设置的自动更换等分样品功能测量样品。

铜络合测量通过差分脉冲伏安法的典型扫描参数为：在-0.1 mV下沉积240秒，平衡10秒，起始电位-0.1 V，终止电位-0.5 V，调制幅度25 mV，调制时间50 ms，间隔时间250 ms，步长3.5 mV（扫描速率14 mV/s）。每次测量前，伏安池自动用稀盐酸冲洗，然后用超纯水冲洗，最后用35 g/L NaCl溶液（缓冲至pH 8.2）冲洗。对于铜络合测量，在同一