基于中性化高氯酸（PCA-N）的简化工作流程推动人群规模深度血浆蛋白质组学民主化

本刊推荐：针对大规模血浆蛋白质组学研究在分析深度、通量和成本效益间难以平衡的问题，研究人员开发了一种优化的基于高氯酸并引入中性化步骤的工作流程（PCA-N）。该方案通过在中和沉淀蛋白后直接酶解，无需额外纯化步骤，将样本需求降至仅5 μL，同时保持了深度覆盖。验证显示其虽技术变异略高于NEAT，但保持了优异的生物分辨率和重现性。此工作流程为人群水平的血浆蛋白质组学研究提供了极具吸引力的解决方案，显著降低了深度分析的门槛。

　　

血浆，作为承载着人体健康与疾病状态的宝贵信息库，其蛋白质组成分的深度解析一直是生物医学研究的热点与难点。近年来，血浆蛋白质组学经历了从小规模探索性研究到数万样本量级的人群水平分析的显著转变。这一转变的背后，是学界认识到大规模队列对于稳健的生物标志物（Biomarker）发现至关重要——它能够提供足够的统计效力来识别细微的蛋白质信号，同时考量人群间的生物变异性。质谱（MS）技术的进步是这一变革的关键推动力。

然而，该领域始终面临一个严峻的权衡：如何在分析深度、方法稳健性以及大规模队列研究的实际可行性之间取得平衡。标准的未去除高丰度蛋白（NEAT）血浆分析方案以其简单和高通量著称，但其蛋白质组覆盖深度不足，难以检测到低丰度且具有临床相关性的蛋白质。而诸如基于抗体的去除（Depletion）、纳米颗粒富集、蛋白质沉淀等更复杂的技术，虽然能增加深度，却可能引入新的限制，包括大样本量需求、高昂的单样本成本、有限的通量、长期重复性的挑战以及对不同样本质量的敏感性。这些限制，随着研究规模的不断扩大而愈发凸显，构成了在真正人群规模上广泛开展血浆蛋白质组学研究的壁垒。

随着研究规模和范围的持续扩大，迫切需要能够同时提供全面可靠蛋白质组覆盖和极端大规模队列所需操作效率的工作流程。正是基于这一挑战，由Matthias Mann教授领导的团队在《Molecular & Cellular Proteomics》上发表了他们的最新研究成果，提出了一种新颖的高氯酸（PCA）工作流程实施方案——PCA-N，旨在克服这些长期存在的限制。

研究人员为开展此项研究，主要应用了几项关键技术方法。研究使用了来自健康成年捐赠者的EDTA抗凝血浆样本。核心实验设计遵循临床与实验室标准协会（CLSI）的C64指南，对PCA-N工作流程的分析精密度、重现性和长期稳定性进行了多层面评估，包括短期（5天）和长期（20天）的重复性实验，并设置了分析重复、技术重复和生物重复以量化不同来源的变异。样本制备是关键，团队对比了传统的NEAT工作流程、其新开发的PCA-N工作流程以及此前发表的perCA工作流程。PCA-N工作流程的核心创新是在高氯酸沉淀蛋白后，对含可溶性蛋白的上清液进行中和，从而无需固相萃取（SPE）除盐即可直接进行酶解消化。所有工作流程均采用Bravo液体处理平台进行半自动化操作。后续的液相色谱-质谱（LC-MS）分析则使用Evosep One系统耦合Orbitrap Astral质谱仪，在数据非依赖采集（DIA）模式下进行。所产生的海量质谱数据使用DIA-NN软件进行搜库和定量分析，并采用了多种统计方法进行评估，包括变异系数（CV）计算、稳定性排名分析和t-SNE降维可视化等。此外，研究还纳入了来自一个正在进行的5万样本大规模研究项目（MOMI联盟）中的1705个质控（QC）样本数据，用于在真实世界条件下验证工作流程的长期稳定性。

中性化高氯酸富集血浆蛋白质组学工作流程

本研究对基于高氯酸沉淀的传统方法进行了关键创新。以往的方法（如perCA）在沉淀后，需要对含有富集蛋白的上清液进行固相萃取（SPE）以去除高氯酸并换液，然后才能进行酶解消化。本研究引入了中和步骤：在沉淀并离心后，使用氢氧化钠（NaOH）精确滴定上清液，将高氯酸（HClO₄）中和生成高氯酸钠（NaClO₄）和水。高氯酸钠是常见高氯酸盐中水溶性最高的，从而创造了适合酶解的直接反应环境。这一改变带来了多重优势：样本需求量从perCA的50 μL大幅降低至仅5 μL；由于避免了SPE步骤中的蛋白损失，肽段产率近似翻倍，使得原则上可使用低至1 μL血浆进行分析；工作流程与384孔板兼容，通量提升可达16倍；同时，省略昂贵的SPE板使样本制备试剂成本与NEAT工作流程（低于1美元/样本）相当。在保持与perCA相近的技术变异（CV约16%）和蛋白质组覆盖深度（约1300种蛋白质）的同时，PCA-N的覆盖深度是NEAT工作流程（约640种蛋白质）的两倍，实现了深度与通量、成本的最佳结合。

高氯酸处理富集和耗尽的蛋白质

分析表明，PCA-N工作流程增加深度的机制在于其能平衡蛋白质的动态范围，优先去除了最高丰度的蛋白质。主要被耗尽的蛋白质包括白蛋白、补体C9、铜蓝蛋白（CP）等。而被富集的通常是较低丰度的蛋白质。系统性分析显示，在两种工作流程中均能检测到的蛋白质里，被PCA-N富集的蛋白质表现出优异的技术重现性（平均CV为13.4%），而被耗尽的蛋白质则变异较大（平均CV为36.5%）。这表明PCA-N虽总体技术变异较高，但其变异主要来源于被耗尽的高丰度蛋白，而驱动生物学发现的被富集低丰度蛋白则定量精准。更重要的是，在PCA-N中独特检测到的蛋白质比例远高于在NEAT中独特检测到的比例（67.7% vs 34.9%），凸显了其检测低丰度血浆蛋白质的卓越灵敏度。

基于CLSI C64指南的PCA-N工作流程基准测试

为严格评估PCA-N在潜在临床中的应用，研究首次将CLSI C64指南应用于发现式血浆蛋白质组学工作流程的重现性评估。实验设计包含5个生物重复（不同个体血浆）和5个技术重复（混合QC血浆），在5天内每天制备5次，随后延长至20天每天制备2次。t-SNE降维分析清晰地将PCA-N和NEAT的结果分开，并在每种工作流程内清晰地聚类了技术重复和生物重复。多层次的CV计算表明，NEAT工作流程表现出优异的技术重现性（日内|日间CV为7.7|9.2%），与其分析变异（7.4%）相当。PCA-N工作流程的技术变异约为NEAT的两倍（日内|日间CV为16.1|18.9%）。然而，至关重要的生物变异在两者中比例相似（NEAT增加13.8|13%，PCA-N增加12.3|11.5%），表明尽管绝对技术变异较高，PCA-N仍能提供与NEAT相当的生物分辨率。

重复性

对20天连续样本制备和测量的评估揭示了工作流程在模拟常规临床实验室操作条件下的长期稳定性。通过将定量蛋白质按CV值分为四分位数并评估其排名一致性，发现NEAT和PCA-N工作流程中分别有68%和65%的蛋白质保持了稳定的CV排名类别。尽管PCA-N的绝对CV值较高，但其提供的重复性与常规NEAT方法相当，同时蛋白质组深度翻倍。样本间相关性分析进一步证实，在20天的周期内，来自不同个体的生物样本仍能被清晰区分，证明了PCA-N工作流程卓越的长期重复性。

大规模蛋白质组学研究中的长期稳定性评估

PCA-N工作流程被应用于一个涉及5万血浆样本的大型项目（MOMI联盟）。在此背景下，对系统性地穿插在40920次LC-MS运行中的1705个QC样本进行了分析。t-SNE分析显示，质谱仪是样本分离的主要驱动因素，而不同样本制备批次间未观察到分离，证实了跨批次制备的优异重现性。经过ComBat批次校正后，仪器和批次均不再引起分离。所有QC样本的板内CV为16.0%，与受控的CLSI C64实验中观察到的日内CV高度一致。长期稳定性通过量化CV排名的稳定性来评估，结果显示64.5%的蛋白质在板内和板间测量中保持了一致的CV排名类别，板间Pearson相关性高达0.887。经批次校正后，稳定性进一步提高至82.6%，相关性达0.973。这些结果验证了PCA-N工作流程在极端高通量应用中的稳健性和可扩展性，证明了其作为大规模血浆蛋白质组学研究可靠平台的潜力。

综上所述，本研究开发的PCA-N工作流程通过引入一个简单而有效的中和步骤，对先前的高氯酸沉淀方法进行了关键优化，成功解决了大规模临床队列分析中对深度蛋白质组覆盖、成本效益、高通量和最小样本消耗的多重需求。该方案在将样本需求降至5 μL的同时，实现了与NEAT相当的单样本成本和两倍的蛋白质组深度，其通量能力使之能每天制备超过一万个样本。严格的CLSI C64验证和超过四万样本的实际应用证明，尽管其技术变异略高于NEAT，但PCA-N保持了卓越的生物分辨率和长期重复性，其变异主要来源于被耗尽的高丰度蛋白，而关键的生物信息则被稳健地保留。这项研究标志着血浆蛋白质组学分析的一个重要进步，它极大地降低了进行人群规模深度蛋白质组学分析的技术和经济门槛，为生物标志物的发现和验证建立了新的范式，有望在资源各异的研究环境中推动该领域的民主化进程。