综述：微核中DNA和染色质的细胞内及细胞外命运决定其致病性

本综述系统探讨了微核(MN)的来源、组成及其命运，重点阐述了MN在基因组不稳定性与免疫激活中的关键作用。文章详细解析了MN的形成机制（如无着丝粒片段、整条染色体或双微体的错误分离）、分子特征（包括核膜组成差异）及其动态结局（如重整合、降解或挤出），特别聚焦于微核膜破裂导致的染色体碎裂(chromothripsis)和cGAS-STING通路介导的炎症反应，并探讨了MN来源的DNA/染色质通过细胞外囊泡(EVs)释放至血液、作为循环游离DNA(cfDNA)的潜在生物标志物价值，为疾病（尤其是癌症）的预测与诊疗提供了新视角。

　　

1. 引言

循环游离DNA（cfDNA），尤其是血液中的cfDNA，已成为预测、诊断和监测人类疾病的关键非侵入性生物标志物。此外，细胞质DNA也被证实能促进遗传畸变、基因组不稳定性和炎症，这些因素可能助长包括癌症在内的多种疾病发展。然而，细胞内和细胞外DNA的异质性构成了重大挑战。本综述综合了当前关于微核（MN）及其衍生的DNA/染色质的起源、组成和命运的证据，强调了它们作为基因组不稳定性和免疫激活的积极参与者的潜力。

2. 微核的起源

微核是由微核膜（mNE）包裹的核外小体。与核膜（NE）相比，微核膜的蛋白质组成发生了改变。例如，核纤层蛋白B1（lamin-B1）的完整性在大多数微核中丧失，部分微核甚至完全缺乏lamin-B1。相反，诸如层粘连蛋白B受体（LBR）和伊默菌素（Emerin）等蛋白质在微核膜中相对富集。

微核可能自发产生于遗传缺陷细胞、基因组不稳定的癌细胞，或由基因毒性应激源（包括断裂剂和非整倍体诱变剂）诱导产生。最近的一项体内研究将145个基因与微核形成增加或减少联系起来。遗传决定因素也可能解释最近的发现，即由癌基因驱动的癌细胞（表现出显著的遗传不稳定性，包括微核）会释放携带基因组DNA的小型细胞外囊泡（EVs）。这些囊泡被原发性内皮细胞摄取，导致微核和其他应激反应的诱导。

暴露于基因毒素后，微核主要来源于有丝分裂过程中未能整合到子核中的无着丝粒片段或整条染色体。这是由于在后期染色体分离过程中纺锤体附着不当所致。除了这些基本的分离错误外，微核也可能在后期由染色体断裂或端粒丢失导致的断裂-融合-桥（BFB）形成而产生。循环BFB是一个过程，其中染色体断裂导致姐妹染色单体在缺乏端粒的断点处融合，从而形成双着丝粒染色体。这些双着丝粒染色体可能在下一个后期再次断裂，使BFB循环持续下去。这种机制可能导致子细胞中的基因扩增或缺失，促进双微体（DMs）的形成，随后可能重新整合到微核中。

微核也可能在间期通过一种称为核出芽的机制形成。2007年，Lindberg等人将核芽描述为通过细核质连接附着在核上的微核样小体。他们的论文提出，微核和核芽具有不同的起源。微核主要来源于滞后染色体和末端无着丝粒片段，而核芽则起源于间质和末端无着丝粒片段。后者可能代表核分裂后从细胞核挤出的多余DNA。2011年，Utani等人描述了通过细胞质膜 blebbing 包裹核芽产生微核的过程。这些微核通常很小，并且通常靠近主核。两种不同的干扰被证明会导致这种类型的微核：扩增的癌基因和多个双微体的出现。微核也可以通过染色中心（帮助维持核内染色体补体的多个染色体着丝粒区域的天然聚集）破坏后的核膜出芽形成。然而，尽管核膜出芽被认为是核质运输所必需的生理和细胞特征，但导致间期核中微核形成的机制仍不清楚。

caspase活性也有助于微核形成。Decordier等人报道，在暴露于诱变剂的caspase-3缺陷型MCF-7细胞系以及当caspase-3被抑制的人外周血细胞中，微核形成减少。2017年，Kiraly等人在几种细胞系中描述了染色质凝缩和凋亡过程中的微核形成。Haimovici等人表明，线粒体凋亡通过激活Caspase-Activated DNase诱导染色体缺陷和微核。关于caspases作为微核的贡献者和/或后果的作用仍不清楚，特别是考虑到已知微核会诱导凋亡。

关于微核（MN）、细胞质染色质灶（CCFs）和其他细胞质膜包围的微观结构（如凋亡小体）之间的区别仍存在一些混淆。凋亡小体和微核的区分可通过凋亡的特异性标记物来促进。CCFs在细胞衰老（与衰老或疾病相关）中被描述，而微核则在细胞达到衰老状态之前形成。然而，目前尚不清楚微核或CCFs是否产生相似或不同的衰老相关炎症反应。

3. 微核DNA/染色质的内容和特征

对微核DNA/染色质内容的简化描述会认为微核包含带有某些片段端粒的无着丝粒染色体片段、带有着丝粒和端粒的整条染色体，或不带着丝粒或端粒的双微体（DMs）。然而，微核在其来源、结构和遗传活性方面表现出显著的多样性。

Pereira等人采用一种精巧的方法对两种具有不同癌症易感性的突变小鼠模型中的微核内容进行了测序。他们的分析揭示了与染色体脆性相关的长基因和基因贫乏区域的基因组扩增，并且在两种模型之间存在明显差异。

最近，一个由SM Harding领导的团队分析了六种不同诱变剂诱导的微核的蛋白质组景观。他们的研究结果显示，尽管诱变剂不同，但微核蛋白质组组成在很大程度上是趋同的，这表明存在独立于特定基因毒性应激源的共享微核形成机制。此外，微核通常缺乏剪接体和DNA损伤修复成分，但富含与复制相关的蛋白质。有趣的是，紫杉醇（一种众所周知的微管解聚抑制剂，可诱导非整倍体和微核形成）的微核膜破裂频率（约75%）高于其他基因毒素。值得注意的是，这些破裂的微核中约有90%被环GMP-AMP合成酶（cGAS）结合，这一主题将在本综述后面进一步探讨。

特别关注由于染色体滞后形成的微核，Agustinus等人在多个人非转化细胞系和癌细胞系以及一个小鼠模型中证明，在染色体错误分离并并入微核后，微核膜破裂会显著破坏组蛋白的翻译后修饰。在微核内，染色质发生压缩，其特征是稳定的异染色质组蛋白修饰增加和动态组蛋白修饰的丧失。这种破坏导致即使染色体重新整合回细胞核后，表观遗传调控仍然失调。

总之，微核的内容高度多样化，受组织来源、应激源类型和遗传背景的影响。此外，微核在DNA复制、损伤感知和修复能力方面独立于主核发挥作用，因为它们不受相同的检查点调控，也不被相同的核膜包裹。更好地理解微核内容中观察到的异质性及其对微核膜破裂的影响，需要对包含无着丝粒染色体片段与整条滞后染色体的微核进行额外的遗传和表观遗传表征。

4. 微核的细胞内命运

早期对微核命运的记载主要强调了四种结果：微核或微核化细胞的降解、重新整合到主核中、从细胞中挤出，或在细胞质中持续存在。最近的研究发现了其他途径，包括与凋亡、微核膜不稳定性或破裂以及基因组改变的联系。

4.1. 通过凋亡清除微核和微核化细胞

微核化细胞可以通过凋亡或衰老被清除。此外，微核可能通过cGAS介导的微核自噬被清除，或经历膜破裂，触发先天免疫反应。

剂量依赖性的微核化细胞通过凋亡的清除在暴露于微管抑制剂的人淋巴细胞中得到证实，该过程被证明是p53依赖性的。最近，Reimann等人发现，虽然大多数微核在多个细胞周期中持续存在，但与非微核化细胞相比，微核化细胞更容易发生细胞死亡、衰老和致命的 mitosis 错误。

4.2. 影响微核膜破裂的因素

微核膜（mNE）破裂在微核的命运及其后果（尤其是癌症）中起着关键作用。因此，理解微核脆性的原因是近期研究的一个主要目标。在一项出色的深入分析中，Guo等人回顾了易破裂和不可修复微核的起源。他们得出结论，这一结果是由生物物理特性（曲率）、细胞内定位（在核内中央或外周）和独特的微核膜特征共同驱动的。

核孔复合体（NPCs）的密度、非核心和NPCs蛋白的延迟招募以及lamin B1的缺陷含量被认为与微核膜脆性有关。微核膜的曲率被认为起着至关重要的作用，因为lamin-B1过于刚性而无法弯曲。因此，lamin-B1不太可能存在于高度弯曲的结构（如微核）中。此外，lamin-B1作为微核膜核自噬的主要底物的观察结果与表达不可降解lamin-B1显著减少微核膜破裂的发现相一致。

关于微核在中期到后期转换期间相对于中央纺锤体微管（CSMs）的相对位置，Liu等人发现，位于纺锤体外周的染色体起源的微核可以招募核心核膜蛋白（位于中央纺锤体区域）和非核心核膜蛋白（位于外周），从而允许在核膜内形成功能性NPCs。相比之下，位于中央的染色体只能招募核心核膜蛋白。因此，来自外周染色体的微核经历的核膜破裂显著少于来自中央定位染色体的微核。

Mammel及其同事对定位和核蛋白招募作为微核膜破裂的原因提出了挑战，相反，他们提出染色体长度和基因密度与Lamin B1水平和微核膜稳定性相关。然而，染色体长度和基因密集区域与核内独特的地理排序相关，这表明两种理论可能相互关联。在人类细胞中，较长的染色体通常更靠外周定位；这表明它们可能有更多机会结合核心和非核心蛋白。

最近，人共济失调毛细血管扩张突变和Rad-3（ATR）激酶被确定为微核膜破裂的调节因子。ATR响应DNA损伤而被激活，被证明在lamin-B阴性的微核中促进微核膜破裂。这种机制被认为通过促进受损DNA和细胞的清除而起到保护作用；然而，它如何与减轻胞质DNA释放的下游后果的过程相互作用仍不清楚。此外，这些发现表明该机制特定于DNA受损的微核，并且在由滞后染色体形成的微核（通常缺乏DNA损伤）中不活跃。展望未来，研究微核命运的实验应包括对着丝粒和端粒的评估，以区分包含无着丝粒片段、整条染色体或双微体的微核。

最后，微核膜修复的可能性是另一个有趣的问题。已知间期主核中不受控制的核膜破裂可以通过ESCRT-III（运输所需的内体分选复合体-III）和BAF（自身整合因子屏障）活性快速修复。相比之下，微核中的核膜修复似乎效率低下，在大多数包含无着丝粒染色体片段的塌陷微核的包膜上观察到ESCRT-III的异常积累。这表明ESCRT-III不能从这些结构中有效回收。同样，BAF在微核破裂位点富集，并可能介导在塌陷微核中观察到的ER-小管入侵。此外，Martin等人假设，微核膜修复可能受到微核靠近线粒体的影响，通过氧化驱动途径。

4.3. 微核膜破裂的后果

微核膜的缺陷和破裂具有主要后果，特别是遗传变化，包括染色体碎裂（chromothripsis），和胞质DNA诱导的炎症。

4.3.1. 遗传后果

微核膜缺陷/破裂有多种遗传后果：i) 染色体碎裂；ii) 可能仍未修复的大规模DNA损伤；iii) 基因组重排和癌基因扩增，可产生称为双微体（DMs）的富含癌基因的环状DNA分子。

染色体碎裂是一种灾难性事件，导致封装在微核中的染色体广泛碎片化。微核通常表现出膜异常，这会损害DNA复制、转录和修复。因此，这可能导致困在微核内的染色体发生广泛的DNA损伤和碎片化（或粉碎）。可能参与染色体碎裂重排的蛋白质包括核酸酶TREX1（三分修复外切核酸酶1）、拓扑异构酶IIb和脱嘌呤/脱嘧啶（AP）内切核酸酶，如APE1，以及自噬受体p62/SQSTM1。如果DNA片段重新整合回主核，可能会发生随机重排，导致超突变染色体。最近，Trivedi等人和Lin等人优雅地证明，破碎的染色体片段在有丝分裂期间通过各种DNA相关蛋白复合物（包括CIP2A-TOPBP1（DNA拓扑异构酶II结合蛋白1））被拴在一起。这些复合物促进片段分离到单个子细胞中，导致可遗传的染色体碎裂重排，这在大多数人类癌症中常见。相反，CIP2A-TOPBP1的失活导致无着丝粒片段随机分散在整个有丝分裂细胞质中并进入两个子细胞。

4.3.2. 胞质DNA诱导的炎症

胞质自身DNA具有高度炎症性，并激活先天免疫反应。这种炎症反应主要由三种DNA传感器介导。Toll样受体9（TLR9）特异性识别CpG基序，该基序在细菌和病毒DNA中丰富。黑色素瘤缺乏因子2（AIM2）检测双链DNA（dsDNA）和DNA/RNA杂交体，激活炎症小体途径。最后，cGAS触发cGAS-STING（干扰素基因刺激因子）信号通路，导致代谢失衡、炎症，并最终促进细胞周期停滞和炎症性衰老。

由于cGAS可能是微核来源DNA的主要传感器，cGAS与微核的相互作用值得更多关注。cGAS通过与双链DNA结合并使其他cGAS分子交联而以序列非依赖性方式被激活。在正常情况下，cGAS感知自身DNA的能力受到限制，阻止其N端可及性，防止cGAS-DNA复合物的 oligomerization。这种调控在静息细胞中主要发生，因为cGAS通过其N端锚定在质膜上，并在有丝分裂期间被高度磷酸化。此外，在有丝分裂期间，cGAS与染色质中的H2A-H2B组蛋白紧密相关。

微核膜破裂以及随后DNA或染色质泄漏到胞质溶胶中，创造了一个非生理环境，允许cGAS与自身DNA/染色质接触。在这种背景下，cGAS的激活取决于无核小体或表观遗传修饰的DNA片段。此外，DNA片段长度可能影响cGAS激活，观察到物种特异性差异——在老鼠中，有效感应需要长于20 bp的片段，而在人类中，片段通常必须超过45 bp。

微核内染色体转运导致的表观遗传失调可能有助于异常的cGAS-DNA相互作用。然而，最近的发现表明微核可能不是cGAS/STING激活的主要来源。Flynn等人报道，虽然染色质桥（以 stretched chromatin 和高度可及的DNA为特征）有效激活了cGAS，但微核招募cGAS而不触发其激活。Sato和Hayashi观察到，cGAS在源自染色体融合的膜破裂微核处积累，但并未激活cGAS-STING通路。不过在后者的情况下，应考虑微核通常不是由染色体融合形成的。唯一例外是当染色体融合导致双着丝粒染色体形成，然后双着丝粒染色体形成后期桥，该桥随后断裂，有时可能产生来自所产生的染色体片段之一的微核。需要额外的实验来澄清这些问题。

这些发现表明，其他因素影响cGAS与DNA的结合。Guo等人系统地研究了cGAS区分自身DNA的关键机制，包括核-质区室化、核小体拴系和翻译后修饰。他们提出，微核的免疫原性通过微核膜破裂增强，受微核内染色质和DNA状态的影响，并进一步受与线粒体DNA相互作用的调节。此外，MacDonald等人提出，cGAS激活可能取决于微核的起源——特别是诱导它的基因毒性应激的类型——以及遗传的染色质特征，例如肿瘤细胞中的组蛋白修饰。

尽管TLR9、AIM2和cGAS传感器各自具有特异性，但已报道存在串扰。此外，cGAS既可以激活促炎反应，也可以抑制先天免疫反应。

总之，微核曾被认为仅仅是染色体不稳定的被动指标，目前被视为强突变表型和能够警报免疫系统的介质。

4.4. 微核来源的染色质-DNA在外泌体中的包装

由于从微核释放的胞质染色质具有促炎潜力，考虑细胞是否能发展出一种针对这种有害胞质DNA释放的保护机制非常重要。胞质DNA可以通过核酸酶TREX1的消化来消除。胞质DNA也可以被BAF结合以尝试修复膜，因为BAF具有一个DNA结合域和一个LEM（LAP2/Emerin/MAN1）结构域蛋白的结合位点。

通过外泌体包装胞质DNA是避免通过排出有害DNA而产生促炎后果的一种替代方法，并与微核相互作用。外泌体通过内吞作用产生，在多泡体（MVBs）内积累，并在与细胞膜融合后释放到细胞外空间。Takahashi等人观察到，抑制外泌体分泌会导致核DNA在胞质溶胶中积累，触发cGAS/STING介导的炎症。最近，Yokoi等人报道了外泌体释放与基因毒素诱导的微核形成之间存在正相关。这表明来自微核的DNA通过核蛋白CD63介导的过程被包装到分泌的外泌体中，CD63与细胞内囊泡（包括微核）的膜相关。然而，需要进一步的研究来充分阐明这一过程中的关键参与者。

已发现肿瘤来源的微泡（tMVs）含有cGAS-dsDNA复合物，并被提出作为胞质DNA挤出的替代机制。然而，该途径与膜破裂后从微核释放的DNA或染色质的命运有何不同仍不清楚。

总之，研究封装在MVs内的微核来源DNA或染色质可能为了解潜在的分子机制提供有价值的见解，并作为信息丰富的生物报告者。

5. 微核或微核来源的染色质对细胞外空间中游离DNA的贡献

在本节中，我们回顾了微核或微核来源的染色质在数量和质量上对cfDNA的贡献程度。来自微核的cfDNA可能与其他EVs（如外泌体和微泡（MVs））的来源显著不同，表明其作为生物标志物的独特潜力。此外，由于微核通常更大——范围从主核大小的1%到10%——它们可能被常规的cfDNA分离方案排除，可能限制它们的检测和研究。

目前，关于微核在血浆、细胞外空间中的存在或其清除动力学的数据有限。几项体外研究观察到微核自发或选择性消除到培养基中。Shimizu等人和Ji等人在培养的人癌细胞中观察到细胞外微核，这些微核似乎富含双微体（DMs）。Nito等人报道了在用丝裂霉素C或长春新碱处理的L-929细胞中通过去核作用挤出微核。在用秋水仙碱或丙烯酰胺体内暴露后的小鼠多染性红细胞中也观察到微核的细胞挤出。挤出的微核主要包含整条染色体。然而，在暴露于其他基因毒性剂（包括依托泊苷）或由其他癌基因（即RAS-3细胞）驱动的癌细胞中，微核挤出很少见，尽管存在大量的微核。因此，微核的挤出可能取决于癌细胞类型和微核的起源，有可能它特定于双微体的清除。

与基因毒性暴露或肿瘤形成无关的微核释放到细胞外空间，最近在发育中的新皮质中被观察到。神经元可以产生微核，这些微核在释放后被小胶质细胞摄取。这个过程诱导小胶质细胞发生形态变化，该变化依赖于cGAS表达。值得注意的是，含有神经元微核的小胶质细胞表现出独特的转录组特征，可能导致新的小胶质细胞状态。此外，早期研究表明，所谓的微细胞（通过排除含双微体的微核形成）可能被细胞重新捕获。

最后，微核来源的DNA或染色质的主动挤出可能通过EVs间接发生。如前所述，外泌体通过排出有害DNA并