液滴数字PCR技术高敏检测TERT启动子突变在肝癌诊断及预后评估中的临床应用

本文创新性采用ddPCR（液滴数字PCR）技术同步检测TERTp两个热点突变（C228T/C250T），在肝细胞癌（HCC）和肝母细胞瘤（HB）组织及游离DNA中实现0.1%超高灵敏度检测，证实TERTp突变是HB患者不良预后的关键指标，为癌症分子诊断提供突破性技术方案。

　　

亮点

• 建立同时检测TERTp两个热点突变的ddPCR（液滴数字PCR）新方法

• 在HB和HCC组织及cfDNA（循环游离DNA）中实现0.1%超高灵敏度检测

• 首次揭示TERTp突变与肝母细胞瘤患者不良预后显著相关

样本信息

从日本儿童癌症研究组（JPLT）2017-2022年间接受治疗的97例HB患者（中位年龄13个月）和11例HCC患者（中位年龄59岁）中获得肿瘤组织样本，所有样本均在化疗前采集。HB样本包含55名男性和42名女性，HCC样本包含8名男性和3名女性。

TERTp突变检测

在96例HB样本中检出17例突变，11例HCC样本中检出8例突变。其中22例为C228T亚型，3例为C250T亚型（图1）。在分析的3个细胞系中，HepG2携带C228T突变，其余均为野生型。所有突变均经Sanger测序验证，表明ddPCR检测系统性能优异（补充表1和2）。

TERTp突变检测限

在HepG2细胞中检测到50%突变等位基因频率（MAF）。通过野生型基因组DNA梯度稀释实验证实，该方法对C228T和C250T突变的检测下限可达0.1% MAF。对FFPE（福尔马林固定石蜡包埋）样本的检测灵敏度同样达到0.1%，且与Sanger测序结果完全一致（图2）。

讨论

多重ddPCR技术最新进展使得单次检测可同时分析多个靶点。本研究设计的双探针ddPCR系统不仅能使用微量DNA（包括冷冻组织、FFPE样本和cfDNA）同步检测两个TERTp热点突变，更在单次反应中仅需10ng DNA和两种不同荧光探针即可完成突变等位基因频率（MAF）定量。特别值得注意的是，在血清cfDNA检测中成功检出TERTp突变，为液体活检应用奠定基础。与传统Sanger测序相比，该方法将检测灵敏度从20%提升到0.1%，大幅提升突变检测能力。最后通过临床数据分析发现，携带TERTp突变的HB患者预后显著较差（p<0.01），凸显该方法对改善患者结局的重要临床价值。