BoLrgB通过调控氧化应激下抗氧化通路促进采后西兰花程序性细胞死亡的机制研究

为解决采后西兰花易黄化衰老问题，研究人员探讨了BoLrgB基因在氧化应激下调控程序性细胞死亡（PCD）的作用机制。研究发现，BoLrgB过表达通过抑制抗氧化酶（APX、SOD、CAT）活性，促进活性氧（H2O2、O2-）积累和MDA生成，并诱导叶绿素降解基因和促凋亡基因表达，最终加速PCD进程。该研究为采后蔬菜保鲜提供了新的分子靶点和理论依据。

　　

采后西兰花因其呼吸代谢旺盛，在常温下2–3天就会出现失水黄化，显著影响其商品价值。程序性细胞死亡（Programmed Cell Death, PCD）是西兰花衰老的主要原因，而活性氧（Reactive Oxygen Species, ROS）的过度积累会破坏抗氧化系统，进而促进PCD的发生。褪黑素（melatonin）作为一种天然抗氧化剂，可清除ROS，延缓叶绿素降解，抑制西兰花花蕾PCD的发生。然而，关于西兰花BoLrgB基因在氧化应激下调控PCD的功能尚未见报道。近期发表在《Postharvest Biology and Technology》上的一项研究，系统揭示了BoLrgB通过调控抗氧化通路促进采后西兰花PCD的分子机制，为采后蔬菜保鲜提供了新的理论依据。

研究人员主要采用了分子生物学、生物化学和细胞生物学等多学科技术方法，包括基因过表达、酵母双杂交（Y2H）筛选、双分子荧光互补（BiFC）、荧光素酶互补（LCI）和亚细胞定位等关键技术，以西兰花和转基因拟南芥为材料，结合体外和体内实验验证BoLrgB的功能及其互作蛋白。

3.1. 外源褪黑素处理延缓西兰花黄化和衰老

随着西兰花贮藏时间的延长，叶绿素含量呈下降趋势，但褪黑素处理组的叶绿素含量始终高于对照组。激光共聚焦显微镜观察发现，贮藏初期对照组细胞呈现强烈绿色荧光，随着时间延长，红色荧光增强而绿色荧光逐渐减弱。第三天时，处理组绿色荧光强度显著高于对照组。qRT-PCR结果显示，处理组BoLrgB表达量在第一天就低于对照组，表明褪黑素处理可有效延缓叶绿素降解和细胞凋亡，并抑制BoLrgB表达。

3.2. BoLrgB过表达降低拟南芥抗氧化水平

在T3代阳性植株中筛选出BoLrgB高表达的转基因拟南芥株系（OE13、OE18、OE24）。经甲基紫精（Methyl Viologen, MV）处理后，所有转基因株系生长均受到抑制，而部分野生型（WT）拟南芥仍能正常生长。测定发现，转基因株系中H₂O₂、O₂^-和丙二醛（Malondialdehyde, MDA）含量均高于WT，而抗氧化酶APX、SOD和CAT活性则低于WT。相反，过氧化物酶（POD）活性在转基因株系中升高。这些结果表明BoLrgB过表达降低了拟南芥的抗氧化能力。

3.3. BoLrgB过表达影响叶绿素代谢相关基因表达

MV处理后，转基因拟南芥中叶绿素降解相关基因AtPPH、AtSGR1和AtPAO的表达均上调，其中OE18株系表达最高。AtCHL基因在WT中表达下调，而在OE18中表达较高。总体而言，BoLrgB过表达促进了氧化应激下拟南芥叶绿素分解代谢相关基因的表达。

3.4. BoLrgB过表达影响PCD相关基因表达

WT拟南芥中抗凋亡基因（AtBI-1、AtFtsHI、AtDAD1）表达显著上调，且表达水平高于转基因株系。相反，促凋亡基因Atmetacaspase1和Atmetacaspase3在转基因株系中表达上调，OE18株系表达最高。这表明BoLrgB过表达促进了氧化应激下拟南芥PCD的发生。

3.5. Y2H文库筛选BoLrgB互作蛋白

通过酵母双杂交技术，从西兰花cDNA膜文库中筛选出48个与BoLrgB互作的候选蛋白。自激活实验表明pBT3-STE-BoLrgB无自激活现象。Among these, APX (Ascorbate Peroxidase) and MDHAR (Monodehydroascorbate Reductase)与细胞氧化还原稳态维持相关，被选作后续互作验证。

3.6. BoAPX、BoMDHAR和BoLrgB的亚细胞定位

BoLrgB定位于烟草细胞叶绿体膜，而BoAPX和BoMDHAR则位于质膜和叶绿体周围，包裹叶绿体，三者定位区域存在重叠，为蛋白互作提供了空间可能性。

3.7. BoLrgB与BoAPX和BoMDHAR互作

Y2H、BiFC和LCI实验均证实BoLrgB与BoAPX和BoMDHAR在叶绿体中互作。在BiFC实验中，pSPYNE-BoLrgB与pSPYCE-BoAPX或pSPYCE-BoMDHAR组合在烟草叶片细胞中发出黄色荧光，与叶绿体自发红色荧光重叠，而对照组无此现象。LCI实验也检测到发光信号，进一步验证了它们的互作关系。

3.8. BoLrgB瞬时过表达影响西兰花抗氧化能力

瞬时过表达BoLrgB后，西兰花中BoAPX和BoMDHAR基因表达下降，ROS荧光强度高于对照组，ASA含量无显著变化。这表明BoLrgB过表达可抑制BoAPX和BoMDHAR基因表达，促进ROS积累，降低西兰花的抗氧化能力。

讨论与结论

本研究系统揭示了BoLrgB在调控采后西兰花PCD中的关键作用。BoLrgB过表达通过抑制抗氧化酶活性，促进ROS积累和脂质过氧化，诱导叶绿素降解和PCD相关基因表达，从而加速衰老进程。更重要的是，研究发现BoLrgB与BoAPX和BoMDHAR互作，干扰其表达水平，进而促进ROS生成。这一发现不仅阐明了BoLrgB调控PCD的分子机制，还为采后蔬菜保鲜提供了新的分子靶点。

尽管本研究取得了重要进展，但BoLrgB与互作蛋白在调控PCD中的具体分子机制仍需进一步探讨。未来研究可聚焦于BoLrgB-APX/MDHAR互作网络的下游信号通路，以及其在其他园艺作物采后保鲜中的潜在应用价值。该研究成果为开发基于基因调控的采后保鲜技术提供了重要的理论依据和实践指导。