一种可同时鉴别五种禽腺病毒物种（A至E）的新型物种特异性多重PCR检测方法及其现场监测应用

本研究针对禽腺病毒（FAdV）物种共循环及混合感染频发导致的临床检测难题，开发了一种基于fiber和penton base基因保守区的单管多重PCR方法，可同步检测FAdV-A至E五种物种，灵敏度达25拷贝/管，现场样本验证与单重PCR及测序结果100%一致，为禽腺病毒病的精准防控提供了高效技术支撑。

　　

禽腺病毒（Fowl adenovirus, FAdV）是一类无包膜、二十面体结构的DNA病毒，可通过水平和垂直传播导致家禽发生包含体肝炎（IBH）、肝炎-心包积水综合征（HHS）和肌胃糜烂（GE）等疾病，造成严重经济损失。FAdV分为A、B、C、D、E五个物种，涵盖12种血清型（1–7、8a、8b、10和11），这些病毒常在禽群中共存循环，使得早期准确检测成为疾病有效控制的关键。尽管部分FAdV感染呈亚临床状态，但某些血清型（如FAdV-4、FAdV-8b和FAdV-11）与高致病性疫情密切相关。此外，混合感染现象普遍，不仅增加临床诊治难度，还可能通过同源重组引发毒力增强或免疫逃逸，因此亟需建立一种可同时检测并区分所有五种FAdV物种的高效方法。

为此，研究人员开发了一种新型物种特异性单管多重PCR（multiplex PCR） assay，靶向fiber和penton base基因的保守区域，实现一次反应同时检测FAdV-A、B、C、D、E五种物种。该方法的检测灵敏度达到25拷贝/管，在对125株田间分离株（来自79个自然感染病例）的验证中，与单重PCR（singleplex PCR）和Sanger测序结果完全一致。感染谱分析显示，单物种感染占53.2%，双物种混合感染占36.7%，三物种感染占8.9%，四物种感染占1.3%，其中FAdV-D/E共感染最为常见。在毒株水平，FAdV-E（34.4%）占比最高，其次为D（31.2%）、B（20.0%）、C（8.0%）和A（6.4%）。系统发育分析进一步证实，fiber、penton base和hexon基因的完整序列聚类与多重PCR分型结果高度一致。该研究为禽腺病毒病的监测、预防与控制提供了一种快速、灵敏、特异且经济高效的技术手段。

本研究主要关键技术方法包括：物种特异性引物设计（基于fiber和penton base基因保守区）、标准质粒构建（使用pTOP TA V2载体）、单管多重PCR反应体系优化（调整引物浓度、退火温度和循环数），以及测序验证与系统发育分析（采用最大似然法构建进化树）。田间样本来源于韩国动植物检疫局（APQA）通过主动与被动监测收集的79例自然感染病例，包括125株FAdV毒株。

研究结果

Isolation of FAdV strains

八株代表不同血清型的FAdV毒株（包括FAdV-1、-2、-4、-5、-8a、-8b、-10和-11）在LMH细胞中成功增殖，接种48–72小时后出现典型的细胞病变效应（CPE），表现为细胞圆缩、折射性增强、葡萄串样聚集和部分单层脱落。

Development of multiplex PCR

通过优化退火温度（60°C）、循环数（38 cycles）和引物浓度（FAdV-A/B为11 pmol/μL，FAdV-C/D/E为8 pmol/μL），建立了可同时扩增五种物种的多重PCR体系，产物大小分别为1321 bp（A）、1069 bp（B）、769 bp（C）、593 bp（D）和277 bp（E），无非特异性扩增或引物二聚体。

Specificity and sensitivity of multiplex PCR assay

该方法的特异性良好，仅对FAdV目标物种产生扩增，而对EDSV、CIAV、ILTV等其他禽病毒无交叉反应。灵敏度测试显示，多重PCR对多数质粒的检测下限为25拷贝/管，仅pTOP-FAdV-8b在多重条件下的灵敏度较单重PCR低5倍。

Application of multiplex PCR assay

在79例田间感染病例中，多重PCR准确检出所有单一及混合感染类型，最常见混合模式为FAdV-D/E（16例），测序验证结果与PCR分型完全一致。

Phylogenetic analysis

基于fiber、penton base和hexon基因完整序列的系统发育分析显示，所有毒株均按物种形成明显聚类，且hexon基因进一步区分出FAdV-11、8b、5、8a、4、1和2等七种血清型，支持多重PCR分型的可靠性。

研究结论与意义

本研究首次建立了可同步鉴别五种FAdV物种的单管多重PCR方法，具有操作简便、灵敏度高、特异性强等优点，尤其适用于田间混合感染的快速筛查。研究发现混合感染比例高达46.8%，凸显其流行病学重要性，且FAdV-D和E为优势流行物种。该检测方法为禽腺病毒病的实时监测、疫苗研发和防控策略制定提供了重要技术工具，尤其有助于应对重组毒株出现和跨种传播风险。未来研究应进一步评估混合感染的致病性，并开发血清型水平的分型方法以提升监测精度。