巴西固氮螺菌Sp7中MibR与LibR协同调控ipdC基因转录及生长素合成的新机制

本研究针对植物根际促生菌(PGPR)巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)Sp7菌株中吲哚-3-乙酸(IAA)生物合成关键基因ipdC的转录调控机制展开探索。研究人员通过DNA亲和层析技术首次鉴定出两个新型转录调节因子LibR（LuxR家族）和MibR（MarR家族），通过构建单突变体和双突变体证实二者通过正向调控ipdC表达影响IAA生物合成，双突变体(ΔlibR/ΔmibR)使IAA产量降低51%。该研究为解析PGPR-植物互作中植物激素调控网络提供了重要分子基础，对农业微生物制剂开发具有指导意义。

　　

在植物与微生物共生的神秘世界中，根际促生菌(PGPR)扮演着至关重要的角色。其中，巴西固氮螺菌(Azospirillum brasilense)作为研究最深入的PGPR之一，能够通过多种机制促进植物生长，其中最引人注目的是其合成植物激素吲哚-3-乙酸(IAA)的能力。IAA不仅是植物生长发育的关键调节因子，更是细菌-植物相互作用的信号分子。在巴西固氮螺菌中，IAA生物合成主要通过吲哚-3-丙酮酸(IPyA)途径完成，而该途径的关键酶——苯丙氨酸脱羧酶(PPDC)则由ipdC基因编码。

尽管前人研究发现ipdC基因启动子区域存在高度保守的顺式作用元件，包括σ⁵⁴结合位点、生长素响应元件(AuxRE)和反向重复序列(IR)，暗示可能存在转录因子的调控，但长期以来，直接与该区域互作的蛋白质身份及其调控机制始终是个未解之谜。这个黑匣子的存在，限制了我们全面理解巴西固氮螺菌如何精确调控IAA合成以适应复杂多变的根际环境。

为了揭开这个谜团，来自墨西哥普埃布拉自治大学的研究团队在《Research in Microbiology》上发表了他们的最新研究成果。他们采用DNA亲和层析技术从巴西固氮螺菌Sp7菌株中筛选到了两个与ipdC启动子区域特异性结合的蛋白质，通过质谱鉴定确定为LuxR家族和MarR家族的转录调节因子，分别命名为LibR（LuxR-like indole-3-acetic acid biosynthesis Regulator）和MibR（MarR-like indole-3-acetic acid biosynthesis Regulator）。

研究人员通过生物信息学分析、基因敲除、回补实验、IAA含量测定和实时荧光定量PCR等技术手段，系统地探究了这两个转录因子在ipdC基因表达和IAA生物合成中的功能。研究发现LibR蛋白含有典型的REC（信号接收）结构域和HTH（螺旋-转角-螺旋）DNA结合结构域，其第7、8和54位的天冬氨酸残基可能是磷酸化位点，暗示其可能通过磷酸化修饰激活调控功能。MibR则含有MarR家族特征性的HTH DNA结合结构域。

实验结果表明，libR单突变体(2113)的IAA产量降低了35%，而mibR单突变体(2114)的IAA产量未见显著变化。然而，当研究人员构建了libR-mibR双突变体(2115)后，发现IAA产量显著降低了51%，表明这两个转录因子在调控IAA合成中存在协同作用。通过回补实验将libR基因重新导入突变体后，IAA产量恢复到野生型水平，进一步证实了LibR的功能。

在基因表达水平上，RT-qPCR分析显示，在缺乏色氨酸的条件下，libR突变体中ipdC表达量下降了4倍，而双突变体中下降了6倍；在添加色氨酸的条件下，libR突变体和双突变体中ipdC表达量分别下降了5倍和7倍。这些结果明确表明LibR是ipdC基因的正向调控因子，而MibR可能通过与LibR的协同作用参与调控。

从技术方法层面看，本研究主要运用了DNA亲和层析技术筛选DNA结合蛋白、LC-MS/MS进行蛋白质鉴定、同源重组构建基因敲除突变体、高效液相色谱(HPLC)定量IAA含量、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)分析基因表达水平等关键技术。

3.1. 生物信息学分析揭示ipdC调控区域特征

研究人员通过对ipdC基因启动子区域的生物信息学分析，确认了该区域存在σ⁵⁴结合位点、生长素响应元件(AuxRE)和一个具有8个核苷酸反向重复的20bp序列，这些元件的存在暗示了转录因子调控的可能性。

3.2. DNA亲和层析鉴定ipdC结合蛋白

通过DNA亲和层析技术，研究人员成功从巴西固氮螺菌Sp7的蛋白质提取物中分离出四个与ipdC启动子区域结合的蛋白质，分子量分别为145、77、25和17 kDa。质谱鉴定结果显示，这些蛋白质包括RNA聚合酶β亚基、多聚核苷酸核苷酸转移酶，以及两个含有HTH结构域的转录调节因子——LuxR家族和MarR家族成员。

3.3. LibR和MibR的结构特征

生物信息学分析表明，LibR蛋白含有REC结构域(1-115氨基酸)和HTH结构域(151-208氨基酸)，其结构与FlcA(62%同源性)、EraR(28%同源性)和NarL(31%同源性)相似。MibR蛋白则含有典型的MarR家族HTH结构域(50-150氨基酸)。

3.4. 基因突变对IAA生物合成的影响

通过构建单突变体和双突变体，研究人员发现libR突变使IAA产量降低35%，而双突变体使IAA产量降低51%，表明LibR和MibR在调控IAA合成中具有协同作用。ipdC完全突变体则使IAA产量降低87%，证实IPyA途径是巴西固氮螺菌IAA合成的主要途径。

3.5. 基因突变对ipdC表达的影响

RT-qPCR分析显示，libR突变使ipdC表达量显著下降，而双突变体的下降程度更为明显，表明这两个转录因子共同参与ipdC基因的正向调控。

研究结论与讨论部分指出，这项工作首次在巴西固氮螺菌Sp7中鉴定出直接参与ipdC基因转录调控的蛋白质因子LibR和MibR。LibR作为LuxR家族转录因子，可能通过磷酸化修饰激活其对ipdC的调控功能；而MibR作为MarR家族成员，可能通过与小分子配体（如IAA本身）结合来调节其DNA结合活性。这两个转录因子的协同作用为理解PGPR中植物激素合成的精细调控网络提供了新的视角。

该研究的重要意义在于：首先，它填补了我们对PGPR中IAA合成调控机制认识的空白；其次，鉴定出的转录因子为未来开发高效植物促生菌制剂提供了潜在的分子靶点；最后，研究结果为进一步解析细菌-植物相互作用的信号传导机制奠定了坚实基础。这些发现不仅对基础微生物学研究有重要贡献，也对农业可持续发展具有潜在的应用价值。