基于激光诱导荧光毛细管电泳的飞摩尔灵敏度单细胞N-糖分析技术研究及其应用

本研究针对痕量样本中糖组学分析灵敏度不足的难题，开发了一种基于毛细管电泳-激光诱导荧光（CE-LIF）技术的单细胞N-糖分析平台。通过定制化LIF系统（灵敏度提升3个数量级）和电动超载进样技术（EKS，灵敏度再提升3个数量级），实现了飞摩尔级（4.7 fM）检测限，成功完成HeLa细胞单细胞水平N-糖谱解析，为细胞异质性研究、精准医疗和临床诊断提供了突破性技术支撑。

　　

在生命科学领域，糖组学（Glycomics）正成为揭示生命过程奥秘的重要研究方向。糖类分子（Glycans）广泛参与细胞间通讯、免疫应答和信号传导等关键生物学过程，其结构异常与癌症、自身免疫性疾病、感染性疾病等多种人类疾病密切相关。尤其值得关注的是，单细胞水平的糖谱分析对于理解细胞异质性、开发精准药物递送系统和实现微创诊断具有重大意义。然而，当前糖分析技术面临严峻挑战：痕量样本中糖分子数量有限、缺乏类似PCR的扩增技术，以及分析流程中的样本损失问题，导致灵敏度难以满足单细胞分析需求。传统方法如DNA条形码凝集素技术受限于探针可用性，而无标记CE-MS（毛细管电泳-质谱联用）技术虽能减少样本损失，却无法检测所有糖类物种。在这一背景下，日本九州大学的研究团队在《Sensors and Actuators B: Chemical》上发表了一项突破性研究，通过技术创新实现了飞摩尔灵敏度的单细胞N-糖分析。

研究团队采用了两大核心技术策略：定制化激光诱导荧光（LIF）检测系统和电动超载进样（EKS）技术。样本来源于HeLa细胞系，通过玻璃微针采集单细胞后进行甲醇固定和真空干燥处理。关键技术方法包括：1）基于APTS（8-aminopyrene-1,3,6-trisulfonic acid）标记的糖分子衍生化技术，赋予糖分子强负电荷和荧光特性；2）聚丙烯酰胺涂层毛细管制备技术以抑制电渗流；3）氢氟酸蚀刻检测窗技术减少光折射；4）EKS进样 protocol 结合场放大样品进样（FASI）和瞬时等电聚焦（tITP）实现样品预浓缩；5）葡萄糖单位（GU）校准算法采用三重内标法（G2、G3、G15）进行迁移时间校正。

3.1. 定制化激光诱导荧光系统

研究团队针对APTS标记糖分子的光谱特性（最大激发/发射波长455/512 nm），自主搭建了LIF检测系统。采用450 nm激光源和530±55 nm带通滤波器，配合数值孔径0.95的物镜和油浸没系统，显著提升荧光收集效率。经检测窗蚀刻处理（从163 μm减薄至50 μm）后，光折射损失大幅降低。与商用LIF系统对比测试显示：定制系统信噪比（SNR）达21958，比488 nm商用系统提升1800倍（3个数量级），对APTS的检测限可达12 pM。

3.2. 基于电动超载进样的在线样品预浓缩

EKS技术通过FASI（10 kV/5 min）和tITP（30 kV/2 min）两步实现样品高效富集。与常规水力进样（0.3 psi/30 s）相比，EKS对葡萄糖梯度的各寡糖组分灵敏度增强因子（SEF）均超过1600倍。采用G7标准品建立的校准曲线显示，该方法检测限低至4.7 fM（100 attomole，SNR=3），实现了飞摩尔级灵敏度。

3.3. 葡萄糖单位注释

利用葡萄糖梯度外标建立GU-迁移时间校准曲线（R²>0.9998），结合三重内标法校正运行间迁移时间偏差（RSD<1.8%）。对HeLa细胞N-糖谱分析共注释12个典型峰（GU 5.2-10.4），与水力进样结果对比显示GU值误差小于1.4%，证实了EKS进样模式下糖谱分析的可靠性。

3.4. 单细胞N-糖分析

采用尖端直径10 μm的玻璃微针采集单/双HeLa细胞，成功获得单细胞水平N-糖谱。与批量细胞样本相比，单细胞样本中GU>10.4的未知峰相对丰度更高，而GU<6.5的糖链比例降低。不同细胞间特定糖链（如GU 6.5和9.8）的峰高比差异揭示了细胞间糖基化异质性，为单细胞糖组学研究提供了直接证据。

该研究通过系统性的技术创新，将CE-LIF技术的分析灵敏度推升至飞摩尔级别（4.7 fM），实现了单细胞水平N-糖谱的精准解析。定制化LIF系统针对APTS标记糖分子的光学特性优化，带来3个数量级的灵敏度提升；EKS进样技术通过电场驱动样品富集，再实现3个数量级的灵敏度增强。研究中建立的GU注释方法（误差<1.4%）保证了糖结构鉴定的可靠性，而单细胞分析结果首次揭示了细胞间糖基化模式的异质性特征。这项技术不仅为糖组学研究提供了超灵敏分析工具，更在肿瘤微区分析、稀有样本表征、细胞异质性研究等领域展现出重大应用潜力。未来研究可进一步优化样品前处理流程的集成化和自动化，拓展至CE-MS联用技术以实现更全面的糖结构解析，推动精准医疗和临床诊断技术的发展。