基于甘蔗衍生三维碳纳米球交联气凝胶共固定辣根过氧化物酶和乳酸氧化酶的双酶乳酸生物传感器开发及其在真实样品检测中的应用

为解决传统乳酸检测方法耗时、设备昂贵及单酶传感器选择性差的问题，研究人员开发了基于甘蔗衍生三维碳纳米球气凝胶(3D-CNCAs)共固定HRP和LOD的双酶生物传感器。该传感器实现了1-1690 μM宽线性范围、0.23 μM低检测限和87%的30天稳定性，成功应用于乳酸酸乳膏和商业饮料检测，为复杂体系中乳酸快速检测提供了新方案。

　　

乳酸作为一种重要的代谢中间体，在食品工业中可反映发酵过程和食品新鲜度，在临床诊断中与代谢紊乱和呼吸功能不全相关，在运动医学中可用于评估运动员的最大运动能力。然而，人体内乳酸水平过高可能导致乳酸中毒，引发疲劳、昏迷甚至死亡。因此，开发简单、灵敏、准确的乳酸检测方法至关重要。传统检测方法如液相色谱、比色法、分光光度法和毛细管电泳往往耗时较长，需要昂贵设备和繁琐样品处理，限制了其广泛应用。电化学生物传感器因其灵敏度高、选择性好、响应快速、操作简单而备受青睐，其中基于酶催化氧化还原反应的安培生物传感器应用广泛。近年来，使用乳酸氧化酶(LOD)的电化学生物传感器已被开发用于乳酸检测，但这类方法通常需要在较高过电位(>0.6 V vs. Ag/AgCl)下氧化过氧化氢(H₂O₂)，这会导致一些电活性物质(如尿酸、对乙酰氨基酚和抗坏血酸)在高压下发生电化学氧化，从而影响传感器选择性。

为解决这一问题，研究人员尝试了多种方法，如在电极上修饰带负电的薄膜(如Nafion膜)或其他选择性催化剂(如酞菁、金属铂颗粒和卟啉)来降低H₂O₂氧化的过电位。由于酶反应的放大作用和固有选择性，辣根过氧化物酶(HRP)常被用作H₂O₂还原的电子中继。在构建的双酶乳酸生物传感器系统中，LOD在氧存在下催化乳酸氧化反应产生的H₂O₂随后被HRP还原。与单酶生物传感器相比，级联酶反应减少了H₂O₂积累引起的LOD活性损失，提高了双酶生物传感器的灵敏度并放大了电化学响应。

纳米材料因其巨大的比表面积、紧凑的直径、增强的电导率、增加的表面活性和强化学稳定性而被广泛用于生产具有优异分析性能的电化学传感器和生物传感器。这些纳米材料促进了氧化还原蛋白(如酶)活性位点与电极表面之间的直接电子传输，其中碳纳米材料如碳纳米管(CNTs)和石墨烯，已成为构建电化学生物传感器的电极修饰材料。此外，天然富碳生物质作为一种来自植物、动物或其废弃物的可再生有机材料，已被用作合成碳材料的丰富且低成本的前体。生物质衍生碳材料具有大比表面积、多孔结构、高导电性和化学稳定性，有助于电化学传感器的构建。

在这项研究中，研究人员开发了一种新型双酶乳酸生物传感器，通过将HRP和LOD共固定在三维碳纳米球交联碳气凝胶(3D-CNCAs)修饰的电极上，该气凝胶源自甘蔗生物质。3D-CNCAs具有大表面积和多孔结构，在促进HRP电活性中心与生物传感器电极之间的直接电子转移方面起着至关重要的作用。研究人员优化了实验参数包括3D-CNCAs悬浮液用量、两种酶的比例、缓冲液pH值和操作电位。该双酶乳酸生物传感器在1-1690 μM浓度范围内对乳酸呈现线性电流响应，检测限为0.23 μM(S/N=3)，优于基于LOD单酶的生物传感器。该传感器还表现出高选择性、重现性、重复性和长期稳定性(储存30天后保持原始值的87%)，并成功应用于乳酸酸乳膏和商业饮料稀释真实样品中的乳酸检测。其出色的分析性能展示了双酶系统相对于单酶系统的优势，在未来具有广阔的应用前景。

本研究主要采用了以下关键技术方法：通过水热法和碳化法从甘蔗生物质合成3D-CNCAs；使用扫描电子显微镜、X射线衍射、氮吸附-脱附等温线、拉曼光谱、傅里叶变换红外光谱和X射线光电子能谱对材料进行表征；通过滴涂法构建3D-CNCAs修饰的丝网印刷电极(SPE)；采用酶固定化技术将HRP和LOD共固定在修饰电极上；使用循环伏安法和计时安培法等电化学技术评估传感器性能。

3.1. 双酶乳酸生物传感器的设计与机制

双酶乳酸生物传感器的工作机制如下：底物乳酸从溶液本体扩散到修饰SPE表面，在氧气存在下与LOD反应生成丙酮酸和H₂O₂，后者作为HRP的底物。在3D-CNCAs的辅助下，HRP从其氧化态同时再生。HRP和LOD集成在3D-CNCAs表面，促进了产生的H₂O₂向附近HRP位点的扩散，由于传质距离缩短，有利于电子交换，从而提高了生物传感器的灵敏度。

3.2. 3D-CNCAs的表征

SEM显示3D-CNCAs呈现不规则且分散不均匀的纳米球，直径范围在几十到几百纳米之间。XRD图谱显示在22.6°和44.3°处有两个典型衍射峰，分别归因于高度无序碳原子和六方石墨。N₂吸附-脱附等温线显示典型的IV型曲线和滞后环，表明3D-CNCAs中存在介孔。BET比表面积为490.13 m² g^-1，孔径分布主要集中在3.8 nm和34.8 nm附近。拉曼光谱显示D带(1344.3 cm^-1)和G带(1588.1 cm^-1)，I_D/I_G比为2.83，表明存在无序结构或大量缺陷。FT-IR光谱显示3441 cm^-1处的O-H伸缩振动，1629 cm^-1和1541 cm^-1处的C=O轴向变形和C=C特征振动，以及1138 cm^-1处的C-O键。XPS显示C和O元素原子含量分别为91.51 at%和8.49 at%。

3.3. Nafion/HRP/3D-CNCAs/SPE对H₂O₂还原的电化学性能

在评估双酶乳酸生物传感器性能之前，首先研究了HRP对H₂O₂的还原。CV显示在存在1.0 mM H₂O₂时，Nafion/HRP/3D-CNCAs/SPE的还原电流增加，电流密度为15.2 μA cm^-2。计时安培法显示传感器对H₂O₂具有灵敏快速响应，线性范围为5 μM-1400 μM，灵敏度为12.57 μA mM^-1 cm^-2，检测限为0.18 μM。与基于CNTs的传感器相比，3D-CNCAs在改善导电基底与HRP之间的电子转移方面更有效。

3.4. 双酶乳酸生物传感器的特性

3.4.1. 双酶乳酸生物传感器的配置优化

优化参数包括3D-CNCAs悬浮液用量、两种酶的比例、缓冲液pH值和操作电位。当3D-CNCAs悬浮液用量为1.5 μL，HRP与LOD体积比为1:1，pH为7.0，操作电位为0 V时，传感器对10 mM乳酸的电流响应最大。

3.4.2. 乳酸的安培检测

双酶乳酸生物传感器对不同浓度乳酸产生不同的安培电流响应，在1-590 μM和590-1690 μM范围内呈现线性关系，灵敏度为7.03 μA mM^-1 cm^-2，检测限为0.23 μM。与单酶传感器相比，响应显著更明显，线性范围扩大了两个数量级，检测限降低了一个数量级。

3.4.3. 选择性、重复性、重现性和稳定性

在选择性研究中，抗坏血酸、L-半胱氨酸、尿酸、对乙酰氨基酚和多巴胺等可能干扰物质在传感器上产生的信号可忽略不计。重复性测试显示RSD为3.2%，重现性测试显示RSD为2.3%。稳定性测试表明，在4°C储存30天后，传感器保持约87%的原始电流响应值。

3.4.4. 真实样品

将制备的双酶乳酸生物传感器应用于乳酸酸乳膏和商业饮料(aqua more)中乳酸水平的评估。检测结果显示乳酸酸乳膏中乳酸含量为12.15%，与制造商标注的12.0%基本一致。在稀释乳酸酸乳膏和商业饮料中的测量结果显示出令人满意的回收率，在97.4%至100.8%之间。

3.4.5. 3D-CNCAs的可持续性

3D-CNCAs的合成策略表现出多种可持续特性，如低成本、原料丰富易得和环保。合成3D-CNCAs的原材料成本约为每克0.79美元，显著低于其他常见材料，如石墨烯(每克749.13美元)、碳纳米管(每克14.49美元)和石墨(每克3.38美元)。

研究结论表明，基于HRP和LOD在3D-CNCAs修饰电极上共固定并覆盖Nafion膜的双酶乳酸生物传感器成功构建并表征用于乳酸测定。3D-CNCAs凭借其多孔结构和大比表面积，桥接了电极与HRP之间的直接电子转移，并固定了两种酶以确保其活性。该传感器在最佳实验条件下对乳酸检测具有出色的分析特性，包括宽线性范围、低检测限、高灵敏度、显著选择性、良好稳定性和真实样品检测能力。利用生物质衍生碳材料及其在多酶共固定中制备生物传感器的策略有望扩展到其他双酶或多酶传感系统的构建。此外，该双酶乳酸生物传感器与丝网印刷技术集成成功检测人体体液中的生物标志物，展示了其作为可穿戴设备用于原位实时健康监测的潜力。通过集成软件支持的蓝牙传输和数据交互功能，该系统可以快速识别异常生物标志物，为早期疾病诊断和干预提供了重要机会，并促进了在不同临床场景中开发更智能和个性化的治疗策略。

该研究由Yashuang Hei、Lisi Ba、Ling Yu、Bingxiao Zheng、Sisi Wen、Nan Ma和Zhiju Zhao共同完成，发表在《Sensors and Actuators Reports》上，为乳酸检测领域提供了新的解决方案，展示了生物质衍生碳材料在生物传感器构建中的巨大潜力。