基于互锁探针连接介导PCR的超灵敏低频单核苷酸变异检测新技术及其在癌症精准医疗中的应用

本文开发了一种创新的互锁探针连接介导PCR（IP-LMPCR）技术，通过结构约束机制显著提升单核苷酸变异（SNV）检测的特异性与灵敏度，可精准识别低至0.1%突变频率的KRAS G12D等癌症相关变异，为循环肿瘤DNA（ctDNA）分析及精准肿瘤学提供了高效可靠的解决方案。

　　

Materials and reagents

本研究使用的寡核苷酸（表S1）由上海生工生物科技有限公司商业合成，并经HPLC级纯化。DNA序列用1×TE缓冲液（89 mM Tris-borate, 2 mM EDTA, pH 8.3）调整至10 μM储存浓度，并于4°C保存。酶试剂包括Taq DNA连接酶和T4 DNA连接酶，及其相应反应缓冲液和低范围DNA分子量标记物。

Design of interlock probes and working principles for highly specific detection

方案1A示意图展示了杂交、连接和PCR扩增步骤。尽管DNA连接酶对完全匹配序列具有选择性，但我们与其他研究者均发现，即使在没有目标DNA的情况下，DNA连接酶仍可催化单链DNA的连接。此类反应连接产率较低，但这些非特异性背景信号在后续PCR中被显著放大，导致明显的假阳性信号。为解决这一问题，我们设计了互锁探针系统，通过结构刚性约束确保仅在与目标单核苷酸多态性（SNP）完全配对时才发生连接，从而消除野生型（WT）序列的干扰信号。该设计利用匹配与错配杂交体的动力学差异，并充分发挥PCR扩增的固有灵敏度。

Conclusion

我们开发了一种基于DNA互锁探针的系统，用于高灵敏和高特异性地检测KRAS G12D突变。创新的互锁设计有效抑制了探针的自发连接，显著减少了单碱基突变检测中常见的非特异性背景信号。该方法在保持高灵敏度的同时大幅提升了特异性，克服了传统探针的关键局限。互锁探针系统为ctDNA分析提供了新的技术范式，在精准肿瘤学和微小残留病灶监测中具有广阔应用前景。