Trueperella pyogenes多位点序列分型(MLST)方案的开发与应用：揭示动物源性机会致病菌的全球遗传多样性及分子流行病学新视角

本研究针对Trueperella pyogenes缺乏标准化分型方法的现状，开发了基于7个看家基因(adk、gyrB、leuA、metG、recA、tpi、tuf)的多位点序列分型(MLST)方案。通过对114株不同来源菌株的分析，鉴定出91个序列型(ST)，显示出极高的遗传多样性。该方案具有卓越的分辨力(D=0.995)，为全球范围内T. pyogenes感染的分子流行病学研究提供了可重复、可比对的标准化工具，对理解该人畜共患病原体的传播规律和种群结构具有重要意义。

　　

在动物医学领域，Trueperella pyogenes（一种革兰氏阳性细菌）正日益引起关注。这种机会性病原体能够引起家畜和野生动物多种化脓性感染，特别是呼吸系统和生殖系统感染以及不同部位的脓肿。尽管其宿主分布广泛且对畜牧业造成显著经济损失，但人们对T. pyogenes的全球遗传多样性和种群结构仍知之甚少。更令人担忧的是，这种细菌可能作为人畜共患病原体，在免疫受损且与农场动物有密切接触的人群中引起感染。

长期以来，研究人员缺乏一种可靠、可重复且具有高分辨力的分子分型方法来研究T. pyogenes的流行病学特征。虽然此前曾使用过BOX-PCR、ERIC-PCR、(GTG)5-PCR和RAPD-PCR等方法，但这些技术存在标准化程度低、重复性有限等缺陷，限制了实验室间的比较研究。全基因组测序(WGS)和核心基因组MLST(cgMLST)分析虽然分辨力高，但对许多诊断实验室来说并不容易实现。因此，开发一种基于序列的标准化分型方法显得尤为迫切。

在这项发表于《Veterinary Microbiology》的研究中，波兰华沙生命科学大学的研究团队成功开发了针对T. pyogenes的多位点序列分型(MLST)方案，为全球范围内该病原体的遗传多样性评估和分子流行病学研究提供了有力工具。

研究人员主要采用了以下关键技术方法：从公共数据库(NCBI)获取54株T. pyogenes全基因组序列，结合实验室收集的58株临床分离株（来自山羊、绵羊、牛、猪和欧洲野牛）和2株参考菌株；基于比较基因组学分析筛选出7个看家基因(adk、gyrB、leuA、metG、recA、tpi、tuf)作为MLST靶点；通过PCR扩增和Sanger测序获取基因序列；使用MEGA-X、DnaSP、geoBURST和PHYLOViZ等生物信息学工具进行序列分析、系统发育重建和种群结构解析。

3.1. Trueperella pyogenes的等位基因变异

研究人员筛选出的7个看家基因在T. pyogenes基因组中均为单拷贝，片段长度从429bp(tuf)到519bp(leuA)不等。在114株分离株中，各基因座位的等位基因数量从14(tuf)到42(adk)不等，显示出丰富的遗传多态性。所有基因的d_N/d_S比值均小于1，表明这些基因受到稳定选择压力。该MLST方案的分辨力达到0.995(95%CI: 0.992-0.998)，表明其能够有效区分不同菌株。

3.2. Trueperella pyogenes分离株的相关性

基于7个基因座的序列分析，114株T. pyogenes被划分为91个序列型(ST)，其中ST5和ST82各包含4株菌株，为最常见的ST。某些ST与宿主种类存在一定相关性，如ST3、ST4、ST5、ST8、ST9、ST28和ST43仅包含山羊源分离株，而ST23和ST60仅包含猪源分离株。研究人员建立了公开的T. pyogenes MLST数据库(http://pubmlst.org/trueperella-pyogenes)，便于全球数据共享和比较。

3.3. 序列型的系统发育和聚类分析

通过串联7个基因序列构建系统发育树，揭示了T. pyogenes的高度遗传分化。BURST分析识别出6个克隆复合体(CC1-CC6)和76个单独型。大多数克隆复合体由同一宿主来源的ST组成，如CC1仅包含猪源分离株。最小生成树(MST)分析显示分离株按宿主种类聚集，猪源分离株与小反刍动物源分离株聚在一起，牛源分离株与欧洲野牛源分离株关系密切。人类源分离株与牛源分离株聚集在同一分支，提示可能存在 zoonotic transmission（ zoonotic transmission（人畜传播）。未发现ST与分离株地理位置之间的关联。

这项研究首次建立了T. pyogenes的标准MLST分型方案，揭示了该病原体具有高度遗传多样性（114株菌株对应91个ST）。研究人员发现某些序列型与特定宿主种类存在关联，但与地理分布无关，表明T. pyogenes的传播可能更多与宿主特异性而非地域性相关。人类分离株与牛源分离株的聚类关系提示了该病原体的人畜共患潜力，对公共卫生具有重要启示。

该MLST方案的建立为全球范围内T. pyogenes感染的分子流行病学研究提供了标准化、可重复的工具，有助于更好地理解该病原体的种群结构、传播动态和进化规律。相比之前使用的分型方法，MLST具有更高的分辨力和 reproducibility（可重复性），使不同实验室的研究结果能够直接比较。这对于监测感染爆发、追踪传播途径以及制定有效的防控策略具有重要意义。

随着更多菌株数据的不断积累，这一MLST方案将进一步完善我们对T. pyogenes遗传多样性和流行病学特征的理解，为应对这一重要动物病原体带来的挑战提供科学依据。