法国与比利时牛支原体polC st1亚型再现与ST4谱系克隆扩张的流行病学与基因组学研究

本研究针对2018-2024年法国与比利时牛群中牛支原体(Mycoplasma bovis) polC st1亚型的再度崛起现象展开监测。通过Vigimyc网络对498株分离株进行polC分型、耐药性测试及全基因组测序，发现ST4谱系克隆扩张取代了主导的ST8谱系，且未伴随耐药性转变。研究揭示了该谱系抗原变异与milA-like基因的特征，为动物疫病防控提供了关键分子流行病学依据。

　　

牛支原体（Mycoplasma bovis）是引起牛呼吸道疾病（Bovine Respiratory Disease, BRD）、关节炎和乳腺炎的主要病原体，对全球养牛业造成重大经济损失。自196年代在美国首次报道以来，该病原体已通过国际贸易迅速扩散至世界各地。法国自2003年起通过Vigimyc实验室监测网络对反刍动物支原体病进行持续监控，并逐步将范围扩展至比利时。该网络采用基于polC基因分型（subtyping）的分子监测方法，曾发现法国流行的三种polC亚型（st1、st2、st3）中，st2亚型自2000年后逐渐取代st1成为优势菌株，且与抗菌药耐药性（AMR）特征密切相关。

令人意外的是，2019年起法国和比利时均出现polC st1亚型的再度崛起（re-emergence），同时伴随原本占主导地位的st2亚型急剧减少。为探究这一现象背后的流行病学规律和分子机制，研究人员开展了为期6年的系统监测与研究。

本研究首先对2018-2024年间通过Vigimyc网络收集的498株M. bovis分离株（法国364株，比利时134株）进行polC亚型分析。结果显示，2018年两国均未检出st1亚型，但2019年起该亚型比例迅速上升，至2024年分别占法国和比利时分离株的62%和约60%，而st2亚型降至8%。这些新出现的st1菌株（称为st1new）与2000年前分离的st1old菌株在遗传背景和耐药表型上存在显著差异。

为深入解析st1new群体的遗传特征，研究人员对45株polC st1菌株进行全基因组测序（Illumina技术），并对首株2019年分离株F12831进行纳米孔测序（ONT）完成基因组环化。通过PubMLST数据库更新分型方案分析，发现st1new菌株均属于ST4型，而历史st1old菌株属于ST12型。核心基因组系统发育分析表明，ST4与ST12形成明显不同的进化分支，且ST4与ST21-ST134-ST144（即polC st3）亲缘关系最近。

进一步遗传多样性分析显示，法国-比利时ST4菌株间单核苷酸多态性（SNP）数量极低（平均26.6个），显著低于ST8（127.2个）和ST12（211.1个）群体，表明ST4谱系近期发生了克隆扩张。比较基因组学分析未发现ST4特有基因，但鉴定出四个高变区域，包括支原体整合接合元件（MICE）、可变表面脂蛋白（vsp）基因簇、表面抗原bspA和额外拷贝的milA基因（一种具有脂酶活性的免疫原性膜蛋白）。值得注意的是，法国-比利时ST4菌株特有的milA-like基因携带类似艰难梭菌毒素TcdA的结构域，可能与其适应性进化相关。

药敏试验结果表明，ST4群体对大环内酯类（如替米考星）、林可酰胺类、氟喹诺酮类（如恩诺沙星）、四环素类（如土霉素）和氟苯尼考的耐药性与其它亚型相似，但对壮观霉素的敏感性显著高于st2和st3群体（90% ST4菌株MIC≤16μg/mL）。这一发现排除了抗菌药耐药性作为ST4谱系扩张主要驱动力的可能性。

本研究采用多项关键技术：1) 基于Vigimyc监测网络的菌株收集与polC基因分型；2) 琼脂稀释法进行抗菌药敏感性测试（AST）；3) Illumina和纳米孔双平台全基因组测序与组装；4) PubMLST数据库的MLST分型与核心基因组系统发育分析；5) 比较基因组学分析（使用ppanggolin、mafft等工具）。样本来源包括法国和比利时2018-2024年临床分离株，以及1977-1997年历史菌株对照。

通过地理分布分析发现，ST4菌株在法国41个省份和比利时所有5个省均有分布，且与呼吸道疾病临床表现为主（占88%），未发现特殊临床关联。系统发育分析显示，ST4菌株与荷兰（2013年）、德国（2015年）、以色列（2016年）和阿尔及利亚（2018年）分离株亲缘关系较近，表明该谱系可能通过牲畜贸易在欧洲扩散。

研究结论表明，法国和比利时近年来出现的牛支原体polC st1亚型再现现象实际上是由新型ST4谱系克隆扩张所致，而非历史ST12谱系的重新活跃。该谱系具有独特的遗传特征（如milA-like基因）和抗原变异模式，可能通过免疫逃避机制在牛群中传播。与之前ST8谱系 emergence 不同，ST4的扩张未伴随抗菌药耐药性获得，提示其传播优势可能源于其他适应性特征。

该研究首次揭示了牛支原体ST4谱系在欧洲的克隆扩张现象，强调了持续病原分子监测对动物传染病防控的重要性。研究结果提示未来需开展体外竞争实验进一步验证ST4谱系的适应性优势，并加强欧洲层面的协同监测以应对跨境传播风险。相关成果为理解细菌病原体种群动态演变提供了重要案例，发表于《The Veterinary Journal》的专业发现对兽医公共卫生和畜牧业可持续发展具有积极意义。