巨噬细胞/小胶质细胞依赖的IL-34-CSF1R信号通路驱动斑马鱼视网膜色素上皮再生的机制研究

为解决视网膜色素上皮(RPE)损伤修复机制不明的问题，研究人员利用il34和csf1ra/csf1rb突变斑马鱼模型开展RPE再生研究，发现小胶质细胞通过IL-34-CSF1R信号介导的吞噬清除功能驱动损伤部位碎片清除，对RPE和光感受器再生不可或缺。该研究为RPE退行性疾病治疗提供了新靶点。

　　

视网膜色素上皮(RPE)是位于眼底后极部的单层色素上皮细胞，构成了血-视网膜屏障，并与光感受器细胞形成紧密的功能单元，负责维持光感受器的健康和功能。RPE损伤会对视力造成毁灭性影响，包括年龄相关性黄斑变性(AMD)在内的RPE退行性疾病是全球视力丧失的最普遍原因之一，预计到2040年将影响2.88亿人。由于复杂的病因和哺乳动物组织修复能力有限，目前尚无治愈RPE退行性疾病的方法，且人们对RPE再生的内在机制了解甚少。

得益于斑马鱼强大的组织再生能力，研究人员利用转基因品系Tg(rpe65a:nfsB-eGFP)建立了RPE消融模型，通过硝基还原酶(nfsB)介导的代谢物激活实现RPE细胞的定向凋亡，为研究内在RPE再生机制提供了理想平台。先前研究发现先天免疫反应元素在RPE损伤后发挥核心促再生作用，其中巨噬细胞/小胶质细胞表现出时间依赖性的损伤部位浸润动态，并且通过RNA测序(RNA-seq)发现了多个可能调控RPE再生的免疫相关候选基因和通路。

在这项发表于《Cell Reports》的研究中，Leach等人深入探究了细胞因子 interleukin-34(IL-34)及其受体 colony-stimulating factor 1 receptor(CSF1R)在RPE再生中的作用。研究人员主要通过构建il34和csf1ra/csf1rb双突变斑马鱼模型，结合转基因标记(mpeg1:mCherry)和特异性抗体标记(lgals3bpb/4C4)，采用免疫荧光染色、TUNEL检测、BrdU增殖 assay、整体原位杂交等技术，利用共聚焦显微镜成像并通过MATLAB平台RpEGEN进行自动化图像分析，系统研究了RPE再生过程中的细胞动力学和分子机制。

Microglia are indispensable for regeneration after RPE ablation

研究人员发现il34突变体在再生峰值期(4 dpi)出现明显的中央REP缺损，表现为缺乏组织化的色素组织再生，而是保留浅色素团块。通过RpEGEN量化分析显示，il34^-/-幼虫的RPE损伤部位有约78度的大范围区域显示出显著较少的总体色素。重要的是，il34缺失并不影响RPE发育和维持，也未改变基线细胞存活或初始消融严重性。

il34 mutants have fewer RPE-localized macrophages/microglia and delayed debris clearance at early regeneration time points

研究发现il34突变体在2 dpi时RPE层中巨噬细胞/小胶质细胞数量显著减少，但到3 dpi时，mCherry标记的水平在野生型和突变型兄弟姐妹之间相似，表明巨噬细胞/小胶质细胞定位到il34^-/- RPE损伤部位存在延迟。同时，il34^-/- RPE组织中保留了大量eGFP阳性碎片，显著高于野生型对照组。深度分析显示，il34^-/-幼虫中eGFP阳性颗粒的内化深度显著降低，表明IL-34信号可能驱动巨噬细胞/小胶质细胞的吞噬和/或降解功能。

Regeneration occurs in late-stage il34-/- larvae despite early deficits in macrophage/microglia densities and debris clearance

尽管早期存在巨噬细胞/小胶质细胞密度和碎片清除缺陷，但il34突变体在14 dpi时成功实现了RPE再生。研究发现19 dpf的年龄匹配il34^+/+和il34^-/-兄弟姐妹表现出相似的RPE顶端微绒毛和ONL宽度测量值，以及典型的中央视网膜形态，包括延长的光感受器外节和极化的RPE。

csf1rDM larvae show severe degeneration phenotypes at peak regenerative time points

csf1ra/csf1rb双突变(csf1rDM)幼虫在再生峰值期(4 dpi)表现出严重的退化表型。这些动物几乎完全没有视网膜小胶质细胞，在3 dpi时RPE中4C4阳性细胞数为零或极少，而野生型兄弟姐妹中的浸润却很 robust。csf1rDM眼睛中保留了eGFP和pyknotic碎片，显著高于对照组。此外，csf1rDM视网膜还显示出中央组织再生的额外缺陷，包括严重的zpr-1阳性锥体光感受器退化表型。

Regeneration is severely impaired in late-stage csf1rDM larvae

重要的是，csf1rDM动物长期未能再生RPE和光感受器细胞。在14 dpi时，大多数csf1rDM幼虫(4/6)表现出严重表型，其特征是高度色素化但 disorganized 的中央组织团块，缺乏eGFP表达，其中一些阻碍了RPE单层，阻止了上下eGFP阳性RPE组织的极化。底层光感受器层在某些区域出现 hypotrophic 且缺乏外节。

研究结论表明，巨噬细胞/小胶质细胞损伤部位负荷和碎片清除障碍之间存在联系，这可能会影响再生过程，并且可能依赖于IL-34信号传导。证据支持巨噬细胞/小胶质细胞的吞噬作用作为驱动碎片清除的重要机制。小胶质细胞对于修复是必需的，研究人员还确定了一个长期RPE和光感受器再生损伤模型，这为理解潜在退行性疾病相关RPE病理学和评估不同巨噬细胞/小胶质细胞种群在RPE修复反应中的独特作用提供了一个独特的、多用途的体内平台。

讨论部分强调，虽然巨噬细胞/小胶质细胞可以发挥修复作用，但 prolonged 免疫激活可能导致 collateral 组织死亡和退行性疾病进展，如果得不到解决，AMD就是这种情况。越来越多的证据表明，不同的巨噬细胞/小胶质细胞种群对眼部病理学的贡献不同。具体来说，单核细胞衍生的巨噬细胞与AMD发病机制有关，而小胶质细胞则与防止视网膜变性的保护作用有关。这项研究为这一悖论提供了见解，表明确实小胶质细胞是RPE成功再生的主要白细胞，并且不同的巨噬细胞/小胶质细胞种群在再生反应中可能发挥功能上不同的作用。

该研究的重要意义在于揭示了IL-34-CSF1R信号通路在RPE再生中的关键作用，强调了小胶质细胞介导的吞噬清除功能对于组织修复的重要性，为开发针对RPE退行性疾病的新型治疗策略提供了重要的理论基础和实验依据。