NRF2激活通过抑制肿瘤微环境免疫浸润促进癌症恶性进展

本研究针对NRF2高活化癌症患者免疫治疗抵抗的临床难题，通过建立Keap1/Nrf2基因编辑的3LL同源小鼠模型，首次证实癌细胞中NRF2激活直接导致CD45+免疫细胞（特别是髓系细胞和NK细胞）浸润显著减少，并发现SLPI等免疫抑制因子可能介导该过程。该研究为NRF2靶向治疗提供了关键实验依据和新型干预靶点。

　　

在癌症研究领域，核因子红细胞2相关因子2（NRF2）的异常激活已成为肿瘤恶性进展和治疗抵抗的重要驱动因素。临床数据表明，携带KEAP1（Kelch样ECH关联蛋白1）或NRF2突变的非小细胞肺癌患者往往表现出肿瘤微环境中免疫细胞浸润减少的特征，这类"冷肿瘤"对免疫检查点阻断治疗的反应普遍较差。然而，由于临床样本中KEAP1突变常与STK11突变共存，且缺乏能够忠实模拟人体免疫微环境的动物模型，癌细胞中NRF2激活是否直接导致免疫细胞浸润减少这一问题一直悬而未决。

为了解决这一科学难题，日本东北大学的研究团队在《iScience》上发表了最新研究成果。他们通过CRISPR-Cas9基因编辑技术，成功构建了Keap1基因敲除（KEAP1-KO）和Keap1/Nrf2双基因敲除（DKO）的小鼠3LL肺癌细胞系，并利用同源移植模型深入探究了NRF2激活对肿瘤免疫微环境的直接影响。这项研究不仅证实了NRF2激活与免疫细胞浸润减少之间的因果关系，还初步揭示了其潜在分子机制，为开发靶向NRF2的癌症治疗策略提供了重要理论基础。

研究人员主要运用了以下关键技术：通过CRISPR-Cas9构建基因编辑的3LL肺癌细胞系；建立同源小鼠双侧和单侧肿瘤移植模型；采用多色流式细胞术全面分析肿瘤浸润免疫细胞亚群；通过RNA测序进行转录组学和基因集富集分析；利用免疫组化验证关键蛋白表达；采用ELISA检测细胞因子分泌水平。

Generation of NRF2-activated murine lung cancer cell line

研究团队首先通过CRISPR-Cas9技术敲除3LL肺癌细胞中的Keap1基因，成功建立了NRF2持续激活的癌细胞模型。Western blot分析证实KEAP1蛋白完全缺失，而NRF2及其下游靶基因NQO1（NAD(P)H:醌氧化还原酶1）的表达显著上调。RT-qPCR结果进一步显示，NRF2经典靶基因Nqo1和Gsta4（谷胱甘肽S-转移酶α4）的mRNA水平也显著升高，验证了NRF2信号通路的成功激活。

NRF2-activated cancer cells provoke a severe immune cell infiltration decrease

为了研究NRF2激活对肿瘤免疫微环境的影响，研究人员将WT和KEAP1-KO细胞同时移植到同一只小鼠的左右两侧，从而在相同的系统免疫环境下比较两者的差异。结果显示，KEAP1-KO肿瘤的生长速度略快于WT肿瘤。更重要的是，流式细胞术分析发现KEAP1-KO肿瘤中CD45⁺白细胞的比例显著降低（从30%降至9%）。进一步免疫细胞分型显示，NK细胞、B细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和树突状细胞等主要免疫细胞亚群在KEAP1-KO肿瘤中均显著减少，但这些细胞在CD45⁺细胞中的比例保持不变，表明NRF2激活非特异性减少了所有免疫细胞的浸润，而非改变特定亚群的比例。

Decrease of immune cell infiltration into KEAP1-deleted tumors is unrelated to immunosuppressive cells

考虑到免疫抑制性细胞可能参与调控免疫浸润，研究人员重点分析了髓源性抑制细胞（MDSCs）和M2型巨噬细胞。结果发现，单核细胞型M-MDSCs（CD11b⁺Ly6C^highLy6G^-）和多形核PMN-MDSCs（CD11b⁺Ly6C^lowLy6G⁺）在KEAP1-KO肿瘤中反而减少，M2巨噬细胞（CD11b⁺F4/80⁺CD206⁺）比例则无显著变化。调节性T细胞（Treg）在两组肿瘤中均未检测到。这些结果表明，NRF2激活导致的免疫细胞浸润减少并非通过增强免疫抑制性细胞实现。

Unilateral tumor model showing that KEAP1 deletion suppresses the infiltra-tion of immune cells

为排除双侧移植模型中肿瘤间相互影响的可能，研究人员建立了单侧移植模型。结果显示，在独立移植的情况下，KEAP1-KO肿瘤中的CD45⁺细胞比例仍显著低于WT肿瘤（19% vs 31%），且NK细胞、B细胞、巨噬细胞和树突状细胞的数量均减少，再次验证了NRF2激活对免疫细胞浸润的抑制作用。值得注意的是，中性粒细胞在单侧模型中的比例较低（<5%），且两组间无显著差异，这与双侧模型的结果有所不同，提示肿瘤负荷可能影响特定免疫细胞亚群的招募。

NRF2 activation in cancer cells does not induce immune cells in systemic circulation

研究人员进一步分析了肿瘤移植对系统免疫状态的影响。发现WT肿瘤携带小鼠的外周血中髓系细胞和中性粒细胞显著增加，而KEAP1-KO肿瘤携带小鼠则无此现象。两种MDSCs亚群在WT肿瘤小鼠中增加，但在KEAP1-KO肿瘤小鼠中保持不变。B细胞在两组肿瘤小鼠中均减少，而NK细胞和T细胞无明显变化。这些结果表明，NRF2激活的癌细胞能够在避免引发系统抗肿瘤免疫反应的情况下生长，这可能是其免疫逃逸的重要机制。

Decrease of immune cell infiltration in KEAP1-KO tumors is attributable to NRF2 activation

为确认免疫浸润减少确实由NRF2激活引起，研究人员构建了KEAP1和NRF2双敲除（DKO）的3LL细胞。Western blot和RT-qPCR证实DKO细胞中NRF2激活状态被成功逆转。将KEAP1-KO和DKO细胞同时移植到同一只小鼠的两侧后，发现DKO肿瘤中的CD45⁺细胞比例显著高于KEAP1-KO肿瘤（25% vs 10%），且NK细胞、巨噬细胞和中性粒细胞的数量均恢复至接近WT肿瘤水平。免疫组化结果进一步证实，KEAP1-KO肿瘤中NQO1高表达而CD45低表达，而DKO肿瘤中NQO1表达降低，CD45⁺细胞明显增多。这些结果确凿证明了NRF2激活是导致免疫细胞浸润减少的直接原因。

Downregulation of immune system-related pathways in the NRF2-activated tumors

通过RNA测序分析，研究人员发现KEAP1-KO肿瘤中NRF2靶基因显著富集，而DKO肿瘤中这些基因的表达被逆转。主成分分析显示，KEAP1-KO与WT和DKO肿瘤在PC1方向上明显分离，而PC1主要富集于免疫系统相关通路。基因集富集分析表明，炎症反应和干扰素γ反应相关基因在KEAP1-KO肿瘤中显著下调，而在DKO肿瘤中得以恢复。免疫检查点分子CD274（PD-L1）和CTLA4的表达在KEAP1-KO肿瘤中也降低， likely反映了免疫细胞浸润的减少。

Expression of immunosuppressive factors in NRF2-activated cancer cells

为探究NRF2抑制免疫细胞浸润的机制，研究人员比较了不同基因型癌细胞的转录组差异，发现88个基因在KEAP1-KO细胞中上调而在DKO细胞中下调。其中Il7、Serpinb9e和Slpi（分泌性白细胞蛋白酶抑制剂）因已知的免疫抑制功能成为重点关注对象。这些基因在KEAP1-KO癌细胞和肿瘤中高表达，在DKO中低表达。ELISA检测进一步发现，SLPI在KEAP1-KO细胞的培养上清中显著分泌，而IFN-γ和IL-7未检测到。这些结果表明NRF2可能直接调控这些免疫抑制因子的表达，从而抑制免疫细胞向肿瘤的浸润。

研究结论与讨论部分指出，这项工作首次通过严格的遗传学实验证明了癌细胞中NRF2激活直接导致肿瘤免疫微环境中免疫细胞浸润减少，成功建立了能够模拟临床NRF2激活癌症免疫表型的小鼠模型。研究发现NRF2激活的癌细胞不仅局部抑制免疫细胞浸润，还能避免引发系统抗肿瘤免疫反应，这种"双重保险"机制可能是其免疫逃逸和治疗抵抗的重要原因。

机制探索方面，研究鉴定出IL-7、SERPINB9和SLPI等潜在NRF2靶基因可能介导免疫抑制效应，其中SLPI的分泌水平在NRF2激活癌细胞中显著升高尤为值得关注。这些因子可能通过不同机制协同抑制免疫细胞功能：IL-7可能通过持续信号传导诱导免疫细胞死亡；SERPINB9通过抑制颗粒酶B保护癌细胞免受细胞毒性T细胞攻击；SLPI则可能直接抑制免疫细胞活化和迁移。

该研究的临床意义在于为NRF2激活癌症的免疫治疗抵抗提供了机制解释，并提出了靶向NRF2或其下游免疫抑制因子可能恢复抗肿瘤免疫反应的新策略。同时，研究建立的同源移植模型为后续探索NRF2调控肿瘤免疫微环境的详细机制和测试靶向治疗方案提供了宝贵平台。