基于等位基因特异性PCR（AS-PCR）与银纳米粒子可视化技术快速现场鉴别蛙病毒（Ranavirus）感染的研究及其在 amphibian 检疫中的应用

本研究开发了一种基于等位基因特异性PCR（AS-PCR）和银纳米粒子（AgNP）显色技术的快速现场检测方法，可精准鉴别蛙病毒属（Ranavirus）中蛙病毒3型（FV3）和虎蛙病毒（TFV）两种高相似度毒株。该方法通过单核苷酸多态性（SNP）分型实现多重检测，反应时间短（<40分钟）、灵敏度高（检测限达1 ng/μL），并可通过UV诱导的AgNP显色反应直观判断感染类型，为两栖动物贸易与保护提供了高效的现场检疫方案。

　　

¹材料

两种DNA模板由Cosmogenetech（韩国首尔）合成。Taq DNA聚合酶、PCR缓冲溶液和dNTPs购自Biofact（韩国大田）。100 bp DNA ladder取自Takara（日本滋贺）。基于溴化乙锭（EtBr）的染料Loading STAR购自DyneBio（韩国首尔）。DMSO溶液（99.9%）来自Biosesang（韩国龙仁）。琼脂糖粉末购自BioShop（加拿大安大略）。FTA经典卡、FTA纯化试剂和FTA核酸释放试剂取自GE Healthcare（美国芝加哥）。硝酸银（AgNO₃）和氢氧化钠（NaOH）溶液购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州）。所有实验用水均为超纯水（18.2 MΩ·cm）。

²数据检索与验证

在构建PCR策略前，我们对蛙病毒遗传数据进行了调研。主要衣壳蛋白（MCP）基因是蛙病毒的遗传标记，因其在基因组中世代稳定遗传（Mishra等，2017；Park等，2021）。我们从NCBI汇编水平收集了90个MCP基因，范围从完整密码子序列到完整基因组（图S1）。为加强数据可靠性，我们另选取了47篇已发表文章中的MCP基因进行进一步分析。

³结论

本研究开发的PCR方法显著缩短了检测时间，仅需约37分钟，而标准PCR通常需要1小时或更长时间进行相同基因组分析。此外，所采用的引物策略能够检测两个目标DNA模板上的两个不同SNP位点。这对于鉴定杂交蛙病毒毒株或检测同一两栖动物感染多种蛙病毒类型尤为有用（图S4）。作为……