间充质基质细胞靶向递送CXCL10增强过继T细胞治疗实体瘤效果

本研究针对实体瘤免疫治疗中T细胞浸润不足的难题，开发了表达NQO1和CXCL10-Fc的工程化间充质基质细胞(NIP-MSCs)。该平台通过增强细胞在肿瘤微环境中的存活能力，实现CXCL10的持续局部释放，显著提升CD8+ T细胞肿瘤浸润，并有效增强过继细胞治疗(ACT)的抗肿瘤效果，为克服免疫治疗耐药提供了新策略。

　　

在癌症免疫治疗领域，实体瘤的治疗效果一直面临重大挑战。尽管免疫检查点阻断(ICB)和过继细胞治疗(ACT)等技术取得了显著进展，但治疗效果往往受到肿瘤微环境(TME)中T细胞浸润不足的限制。这种现象被称为"免疫排斥"或"免疫冷肿瘤"，成为许多患者无法从免疫治疗中获益的关键障碍。

T细胞向肿瘤部位的迁移是一个精密调控的过程，其中化疗因子及其受体系统发挥着核心作用。C-X-C motif chemokine receptor 3 (CXCR3)及其配体轴特别重要，能够引导细胞毒性T淋巴细胞进入实体瘤。在CXCR3的三种配体（CXCL9、CXCL10和CXCL11）中，CXCL10（也称为干扰素-γ诱导蛋白10，IP-10）因其广泛的表达模式和跨实验模型的一致性活性而成为有吸引力的治疗候选分子。

然而，直接将CXCL10应用于治疗面临诸多挑战：天然的CXCL10生物半衰期短，容易被快速清除；全身给药会导致系统性泄漏，无法在肿瘤部位建立有效的浓度梯度；此外，CXCL10易受蛋白酶降解和酶促失活的影响。这些生物学障碍迫切需要新的方法来维持功能性、肿瘤局部的化疗因子梯度，同时最小化系统性分布。

为了解决这些问题，研究人员将目光投向了细胞递送系统。间充质基质细胞(MSCs)因其天然的肿瘤向性、易于基因工程改造以及良好的临床安全性而成为理想的递送载体。然而，MSCs在恶劣的肿瘤微环境中的存活能力有限，这限制了其治疗效果。

在这项发表于《Biomedical Technology》的研究中，研究团队开发了一种创新的工程化细胞平台——通过让MSCs共表达NAD(P)H醌氧化还原酶1(NQO1)和CXCL10-Fc融合蛋白，创造了具有增强生存能力和持续化疗因子递送能力的NIP-MSCs。

研究人员采用了几项关键技术方法：通过慢病毒载体系统进行基因工程改造，使MSCs稳定表达NQO1和CXCL10-Fc；利用多种体外应激模型（缺氧、血清剥夺、酸中毒等）评估工程化细胞的生存能力；通过流式细胞术分析免疫细胞浸润和表型特征；使用 Seahorse XF 分析仪测量细胞代谢功能；建立多种小鼠肿瘤模型（MC38、B16、CT26）进行体内疗效评估；并通过ELISA和细胞追踪技术监测IP10-Fc的生物分布和工程化细胞的持久性。

2.1. 高CXCL10表达与改善的患者生存率和T细胞浸润相关

通过分析TCGA临床数据，研究发现高CXCL10表达与改善的生存结果显著相关。在泛癌分析中，高CXCL10表达患者的总生存期明显延长。多种计算去卷积方法显示，CXCL10表达与多种癌症类型中的CD8⁺ T细胞浸润呈正相关，特别是效应性和记忆性CD8⁺ T细胞。

2.2. 瘤内给药的Cxcl10出现系统性泄漏且无法形成浓度梯度

研究团队设计了小鼠IP10-Fc融合蛋白，并通过瘤内给药评估其生物分布模式。结果显示，给药后血清中检测到显著量的融合蛋白，且在肺、肝、心、肾和脾等多种器官中观察到明显的IP10-Fc泄漏，这些器官中的浓度甚至超过了肿瘤组织本身的浓度。这表明直接蛋白给药无法维持有效的化疗因子梯度。

2.3. 增强的NQO1表达通过维持细胞氧化还原稳态改善MSCs在应激条件下的存活

工程化的NMSCs（表达NQO1的MSCs）在应激条件下表现出显著改善的细胞存活能力。研究发现NQO1过表达提高了NAD⁺/NADH比率，减少了线粒体和胞质活性氧(ROS)水平，保持了线粒体膜完整性，并降低了细胞凋亡。这些改善的代谢参数转化为在模拟肿瘤微环境条件下的增强存活和增殖能力。

2.4. NIP-MSC在TME中实现持久的存活和局部化的IP10-Fc递送

体内实验证实，NMSCs在肿瘤中的持久性显著提高，比对照组MSCs高出59.45%。重要的是，两种细胞类型主要定位于肿瘤组织，在淋巴结、肺、脾或外周血中检测极少。NIP-MSCs在所有测试的应激条件下产生的IP10-Fc水平显著高于IP-MSCs。迁移实验证实NIP-MSC条件培养基显著增强T细胞迁移，与重组IP10-Fc效果相当。

2.5. NIP-MSCs通过增加T细胞向肿瘤部位的浸润展示增强的抗肿瘤效果

在MC38肿瘤模型中，NIP-MSC治疗组显示延长生存期和显著减少肿瘤负荷。免疫表型分析显示NIP-MSC治疗导致肿瘤中CD3⁺ T细胞和CD8⁺ 细胞毒性T淋巴细胞显著增加。值得注意的是，PD1⁺ CD8⁺ T细胞（代表抗原经验性T细胞）和PD1⁺ TIM3⁺ 双阳性细胞（尽管呈现耗竭表型但仍保持细胞毒性能力）显著增加。免疫细胞剔除实验证实CD8⁺ T细胞对于NIP-MSC的治疗效果至关重要。

2.6. NIP-MSCs选择性增强内源性和过继转移T细胞向TME的招募

在B16-OVA肿瘤模型中，NIP-MSC治疗显著增强肿瘤浸润，而肺或肿瘤引流淋巴结中未观察到显著差异。最重要的是，NIP-MSC组显示过继转移T细胞向肿瘤的招募 dramatically 增强，而不影响肺或肿瘤引流淋巴结的浸润，证明NIP-MSCs对ACT具有优越的肿瘤特异性招募能力。

2.7. TME内的CXCL10递送增强过继转移T细胞的治疗效果

在B16-OVA模型中，NIP-MSC与ACT联合治疗显著延长生存期和改善肿瘤控制。流式细胞术分析显示，NIP-MSC和ACT联合治疗组肿瘤中浸润的OT-I T细胞数量显著更高，且这种增强的招募是肿瘤特异性的，在外周血或其他组织中未观察到显著差异。

研究结论和讨论部分强调，这项研究开发的NIP-MSC平台通过解决CXCL10治疗应用中的根本限制，为癌症免疫治疗提供了创新解决方案。工程化MSCs不仅增强了在恶劣肿瘤微环境中的存活能力，还实现了CXCL10的持续局部化生产，建立了有效的化疗因子梯度，显著增强了T细胞向肿瘤的浸润。

该研究的重要意义在于：首先，MSCs作为递送载体具有成熟的临床安全性 profile，便于临床转化；其次，NQO1增强策略主动解决了宿主肿瘤微环境中细胞持久性有限的基本挑战；第三，严格的生物分布分析证实这种平台能够实现高度局部化和稳定的化疗因子梯度，确保有效的T细胞招募同时最小化系统性暴露；最后，对内源性和过继转移T细胞 trafficking 模式的详细分析为联合免疫治疗应用提供了关键见解。

值得注意的是，NIP-MSCs与过继细胞转移观察到的治疗协同作用对于临床转化特别有前景。当前ACT方法，包括肿瘤浸润淋巴细胞疗法和工程化T细胞疗法（如CAR-T细胞），经常面临尽管强大的外周扩张但肿瘤浸润不足的挑战。NIP-MSCs能够显著增强转移T细胞的肿瘤特异性积累而不影响系统性分布，表明这种方法可以降低CAR-T细胞的治疗剂量，同时预防on-target off-tumor效应和系统性毒性如细胞因子释放综合征。

该研究的技术优势在于通过细胞递送实现的优越生物分布 profile。蛋白质注射与NIP-MSC介导递送之间系统性IP10-Fc水平的鲜明对比证明细胞平台如何克服化疗因子基疗法的主要限制，特别是在靶点建立和维持精确化疗因子梯度同时最小化脱靶效应的挑战。