基于TurboID邻近标记技术揭示GALNT3介导的核内O-GalNAc糖基化修饰谱与功能研究

本刊推荐：本研究首次利用TurboID邻近标记技术（TurboID proximity labeling）在活细胞中系统性鉴定核内O-GalNAc糖基化修饰靶点，突破传统认知中O-糖基化仅发生于分泌途径的局限。通过GALNT3-TurboID融合策略，成功捕获26个特征性核蛋白及33个候选蛋白的O-GalNAc修饰位点，为探索核内糖基化在肿瘤发生（如卵巢癌、肺癌）中的新型调控机制提供关键数据支撑。

　　

Section snippets

Cell culture, plasmid constructs and transfection

HeLa与HEK293T细胞购自普赛尔（中国武汉）。细胞在含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中，于37°C、5% CO₂条件下培养。GALNT3基因序列由吉尼斯夫（中国无锡）合成，并克隆至由武汉大学孙慧教授提供的pLenti CMV Puro载体中。该构建体包含TurboID、核定位信号（NLS）以及用于下游检测与纯化的flag标签。慢病毒通过共转染HEK293T细胞生产。

Proximity labeling-based strategy for labeling O-GalNAc modifications in the nucleus of living cells

既往研究报道显示，合成O-GalNAc修饰的关键酶GALNT3在细胞核内存在微弱信号[18]。为此，我们建立了一套基于GALNT3的邻近标记系统，用于标记细胞核内由GALNT3催化的O-GalNAc修饰（图1）。简而言之，我们将GALNT3与生物素连接酶TurboID融合，并在GALNT3的3'端引入核定位信号。在GALNT3-TurboID稳转的HeLa细胞（GT3细胞）培养基中加入生物素，

Discussion

学界普遍认为O-连接糖基化发生于分泌途径，因为参与其合成的糖基转移酶已被报道定位于高尔基体。近年来越来越多的证据表明，参与O-糖基化的糖基转移酶（如C1GALT1和GALNT3）存在于细胞核中，且细胞核具备独立完成O-GalNAc修饰合成的能力[18, 24]。另一种糖基化类型——