综述：短链烷基辅酶M还原酶的新前沿

本综述系统探讨了烷基辅酶M还原酶（ACR）在厌氧古菌甲烷生成与短链烷烃氧化中的核心作用，重点比较了不同ACR亚型在辅因子（如F430）、结构特征、翻译后修饰（PTM）及辅助蛋白组装机制的差异，并指出其异源表达挑战与应用潜力（如CO2生物转化），为理解微生物碳循环分子基础提供新视角。

　　

引言

厌氧古菌通过烷基辅酶M还原酶（ACR）催化甲烷生成与短链烷烃（乙烷、丙烷、丁烷）氧化，在全球碳循环中扮演关键角色。尽管近年来对厌氧烷烃氧化菌（ANKA）的生理学研究取得突破，但由于难以获得纯培养菌株及酶活性敏感性问题，对ACR酶学特性的认知仍有限。本综述通过比较ACR与甲烷生成酶（MCR）的辅因子、结构、翻译后修饰和辅助蛋白系统，揭示其共性特征，并探讨异源表达挑战与应用前景。

厌氧古菌中的烷烃化学

产甲烷古菌利用H₂/CO₂、乙酸、甲酸盐等底物生成甲烷，而厌氧甲烷氧化古菌（ANME）通过逆转MCR反应将甲烷完全氧化为CO₂，并与硫酸盐还原菌建立 syntrophic 合作关系。ANME分为ANME-1（含a-c亚群）、ANME-2（含a-d亚群）和ANME-3三大类群。2016年后，研究发现微生物聚集体可氧化乙烷、丙烷和丁烷，这些多碳烷烃氧化古菌（ANKA）依赖ACR催化烷烃活化，并通过类似ANME的电子传递机制耦合硫酸盐还原。宏基因组数据还提示存在潜在的新古菌类群，但其代谢功能尚未验证。

甲烷生成酶的组织与机制

MCR由α₂β₂γ₂亚基组成，活性中心包含镍辅因子F₄₃₀。反应中甲基辅酶M（CH₃-S-CoM）与辅酶B（CoB-SH）生成甲烷和异二硫化物（CoB-S-S-CoM）。机制研究支持甲基自由基/Ni(II)中间体途径，需高活性Ni(I)启动反应，但该状态难以体外维持。

烷基辅酶M还原酶

逆转MCR反应可实现甲烷固定，ANME中MCR丰度高可能源于甲烷活化难度。从ANME-1、ANME-2c/d分离的MCR结构与产甲烷菌MCR高度相似。乙烷氧化菌ACR结构中存在33?疏水隧道，适应更大底物，且结合辅酶M与辅酶B的方式保守。丁烷/丙烷氧化菌编码4种ACR同工酶，可能识别特定烷基辅酶M变体，但具体机制未明。

F₄₃₀辅因子的变异与蛋白协调

ANME-1 MCR携带17²-甲基硫代-F₄₃₀，而ANME-2则为经典F₄₃₀。乙烷氧化ACR中F₄₃₀存在二甲基化修饰，由甲基转移酶CobM2催化，可能稳定辅因子在扩大的活性腔中的位置。此外，乙烷ACR中谷氨酰胺至甲硫氨酸的替换导致Ni-S配位（而非经典Ni-O），该替换也存在于部分丁烷/丙烷氧化ACR中，但其化学影响待研究。

翻译后修饰及其安装机制

ACR的α亚基含多种PTM，包括5-(S)-甲基精氨酸、2-(S)-甲基谷氨酰胺、S-甲基半胱氨酸、硫代甘氨酸和1-N-甲基组氨酸等。这些PTM由自由基S-腺苷甲硫氨酸（SAM）酶或SAM依赖甲基转移酶安装，如Mmp10催化精氨酸甲基化，MgmA催化谷氨酰胺甲基化。缺失PTM虽不完全失活酶功能，但影响辅酶结合、热稳定性及底物利用效率。ANME-1 MCR独有S-氧代甲硫氨酸和7-羟基色氨酸，ANME-2c含7种PTM为已知最高修饰复杂度，ANME-2d则首次在γ亚基发现3(S)-甲基组氨酸。乙烷ACR保留核心PTM但新增3-甲基异亮氨酸等修饰。丁烷/丙烷氧化菌基因组提示存在2-(S)-甲基谷氨酰胺安装机制。

参与MCR组装与F₄₃₀再激活的辅助蛋白

McrD作为分子伴侣通过构象变化促进F₄₃₀嵌入apo-MCR，但其在ANME-1和乙烷氧化菌中的缺失可能与F₄₃₀变体相关。McrC形成多亚基ATP依赖激活复合物，利用类氮酶金属簇将F₄₃₀还原为Ni(I)活性状态。丁烷/丙烷氧化菌保留大部分激活复合物基因，但缺少Mmp17和DUF2098组分。

逆转ACR反应方向性

热力学与动力学研究表明ACR反应可逆，方向取决于细胞代谢流。乙烷和丁烷氧化菌中存在逆向碳流（如CO₂至丁烷），提示ACR可能用于生物燃料合成。但缺乏纯培养菌株限制应用探索，需通过异源表达推进。

ACR异源表达的启示

近期ACR在产甲烷菌底盘中的异源表达成功实现全酶组装（含F₄₃₀和PTM）。研究表明ACR亚基共翻译组装避免杂交复合物形成，但异源系统难以复现特定PTM安装、F₄₃₀变体及专用伴侣蛋白，可能影响酶功能。优化表达策略有望用于未培养菌酶学研究及烷烃生物转化应用。

未来方向

解析ACR机制需结合异源表达与天然酶分离策略。异源表达和AI预测（如AlphaFold）受限于已知数据，无法预测新PTM或辅因子变体。直接从烷烃氧化菌分离ACR可发现天然特性（如新PTM、隧道结构），但需突破培养技术瓶颈。两类方法互补将推动ACR在合成生物学与碳循环研究中的应用。