鳟鱼鳃上皮细胞在杀鲑鱼立克次体感染下的免疫样应答与自噬调控机制研究

本研究针对智利鲑鱼养殖业中由杀鲑鱼立克次体（Piscirickettsia salmonis）引起的严重病害问题，通过建立虹鳟鱼鳃上皮细胞（RTgill-W1）感染模型，系统研究了该病原体侵染后细胞的免疫应答及自噬（Autophagy）调控机制。研究发现，P. salmonis可激活TLRs、NLRs等模式识别受体（PRRs），上调IL-1β、IL-8、TNFα等促炎细胞因子表达，并诱导自噬相关基因（如 becn1、atg5、lc3等）及LC3-II/I蛋白转化。该研究揭示了鳃上皮细胞在抗胞内病原感染中的关键作用，为开发靶向自噬通路的新型鱼类疫病防控策略提供了理论依据。

　　

在智利，鲑鱼养殖是仅次于铜矿出口的第二大经济支柱，年产值超过50亿美元。然而，养殖虹鳟（Oncorhynchus mykiss）和其他鲑科鱼类常年遭受多种病原体威胁，其中由杀鲑鱼立克次体（Piscirickettsia salmonis）引起的“鲑鱼立克次体症”（Piscirickettsiosis）最为致命，占鲑鱼总死亡数的49.4%，每年造成超过9亿美元的经济损失。这种兼性胞内革兰氏阴性菌可通过鱼的黏膜表面（尤其是鳃部）侵入机体，而鳃组织不仅承担呼吸和渗透调节功能，还具备包括免疫细胞浸润和黏膜免疫分子在内的多种抗病原机制。自噬（Autophagy）作为一种高度保守的细胞内降解系统，在哺乳动物中已被证实可清除胞内病原并受模式识别受体（Pattern Recognition Receptors, PRRs）介导激活。然而，在鱼类中，尤其是面对P. salmonis这类具有重要经济影响的病原体时，鳃细胞自噬的诱导与调控机制尚不明确。

为此，智利天主教瓦尔帕莱索大学（Pontificia Universidad Católica de Valparaíso）的Cristián A. Valenzuela团队在《Fish & Shellfish Immunology》发表论文，首次利用虹鳟鳃上皮细胞系RTgill-W1，系统研究了P. salmonis感染对细胞自噬及免疫样应答的时序性调控，为理解鱼类上皮细胞—病原互作提供了新视角，也为鲑养殖业的病害防控策略开发奠定了理论基础。

本研究采用RTgill-W1细胞系，以P. salmonisLF-89株（ATCC VR-1361）为感染源，通过定量实时聚合酶链反应（qPCR）检测免疫与自噬相关基因表达，蛋白质印迹（Western blot）分析LC3-II/LC3-I转化率，并结合免疫荧光显微镜观察自噬体形成及病原定位。研究设置2、4、6、8、24、48、72和96小时等多个时间点，以模拟短期与长期感染效应，并采用rapamycin（自噬诱导剂）和氯喹（自噬抑制剂）作为对照，系统验证自噬激活状态。

3.1 P. salmonis感染模型在RTgill-W1中的验证

通过检测细菌IV型分泌系统关键基因dotB的表达及免疫荧光显微观察，证实P. salmonis可在感染24小时后侵入RTgill-W1细胞，并于48小时达到感染峰值，成功建立鳃上皮细胞—立克次体感染模型。

3.2 RTgill-W1细胞对P. salmonis的免疫样应答**

qPCR结果显示，感染6小时后，细胞内PRRs（包括tlr3、tlr9、nod1、nod2）及促炎细胞因子（il1β、il8、tnfα）基因表达显著上调，表明上皮细胞具备快速识别病原并启动炎症应答的能力。抗菌肽hepcidin在感染早期亦被诱导，但其表达在24小时下降后于96小时再次升高，提示其可能参与后期免疫调节。

3.3 感染后期自噬的调控

自噬相关基因表达呈时间依赖性变化：atg12与atg4在48小时上调，gabarap于72小时升高，而becn1、atg9、atg5、atg16l1在96小时显著诱导。Western blot分析显示LC3-II/LC3-I比例在24小时明显增加，免疫荧光进一步证实自噬体（LC3 puncta）形成。然而，病原体与自噬体未观察到共定位，暗示P. salmonis可能通过其Dot/Icm系统干扰自噬流，逃避溶酶体降解。

本研究首次揭示虹鳟鳃上皮细胞在P. salmonis感染过程中同时激活免疫应答和自噬通路。尽管上皮细胞能通过PRRs识别病原并启动炎症反应，细菌仍可存活并增殖，其机制可能涉及对自噬—溶酶体融合的破坏。这些发现不仅深化了对鱼类黏膜免疫机制的理解，也为探索通过调控自噬以增强鱼类抗感染能力提供了新思路。该研究强调上皮细胞在抗病原前沿中的角色，并为开发针对胞内细菌感染的免疫干预策略（如自噬诱导型疫苗或佐剂）提供了理论依据和实验模型。