结构引导的L-天冬氨酸-α-脱羧酶工程化改造提升底物耐受性与β-丙氨酸产量

本研究通过理性设计与计算筛选，对BsPanD（L-天冬氨酸-α-脱羧酶）进行多位点突变，显著提升其在高底物浓度下的催化效率与β-丙氨酸转化率，为工业级β-丙氨酸生物合成提供高效、绿色的新策略。

　　

Section snippets

Strains, plasmids, and culture media

使用pET-28a(+)质粒与大肠杆菌（E. coli）JM109和BL21(DE3)表达panD基因及其变体。LB培养基（含10.0 g/L NaCl、10.0 g/L胰蛋白胨和5.0 g/L酵母提取物，可加2%琼脂）用于大肠杆菌种子培养；TB培养基（含24.0 g/L酵母提取物、12.0 g/L胰蛋白胨、5.0 g/L甘油、16.4 g/L K₂HPO₄·3H₂O和2.3 g/L KH₂PO₄）用于摇瓶发酵。所有培养基均在121°C高压灭菌20分钟，必要时添加卡那霉素（终浓度50 μg/mL）。

Catalytic system construction of PanD from various sources

为获取高活性天然酶，从NCBI数据库获取E. coli K12-MG1655、C. glutamicum ATCC 13032和B. subtilis 168的panD基因序列，并通过pET-28a(+)质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中表达。如图2A所示，三种来源的panD均成功表达。EcPanD（大肠杆菌来源）显示三条带：π蛋白（13.8 kDa）、β亚基（2.8 kDa）和α亚基（11 kDa）。CgPanD（谷氨酸棒杆菌来源）和BsPanD（枯草芽孢杆菌来源）均呈现成熟α和β亚基条带，表明其自切割活化过程无需外源激活蛋白参与，这与文献报道一致。

Conclusion

近期研究表明，通过调控质子化网络、优化底物通道构象和调节关键柔性位点可显著提升PanD催化效率（Qian et al., 2020; Wang et al., 2022; Zhang et al., 2018）。本研究通过结合同源建模与计算对接的理性设计，成功获得五个突变体（BsPanD^T4W、BsPanD^I33A、BsPanD^P40N、BsPanD^I88W、BsPanD^N109E），其催化性能显著提升，底物耐受性增强，为工业级β-丙氨酸生产提供了更具潜力的生物催化剂。