新型微孔板圆盘挥发法体外评估气相挥发物的毒性及抗菌活性及其在吸入疗法开发中的应用

本文设计了一种创新的微孔板圆盘挥发法（microplate disc volatilization assay），用于体外高通量筛选气相挥发物的细胞毒性（cytotoxicity）和抗菌活性（antimicrobial activity）。该方法成本低、效率高，为开发新型吸入疗法（inhalation therapy）提供了可靠的体外评估工具，并验证了8-喹啉醇（8-quinolinol）等植物挥发物在治疗呼吸道感染（如肺炎和支气管炎）中的潜在应用价值。

　　

Chemicals and reagents

为验证新型体外检测方法，本研究使用了以下植物源性挥发物：异硫氰酸烯丙酯（allyl isothiocyanate，98%，CAS 57-06-7）、8-喹啉醇（8-quinolinol，99%，CAS 148-24-3）、百里氢醌（thymohydroquinone，98%，CAS 2217-60-9）和百里醌（thymoquinone，99%，CAS 490-91-5）。氨苄青霉素（ampicillin，84.5%，CAS 69-52-3）、5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，99%，CAS 51-21-8）和苯唑西林（oxacillin，86.3%，CAS 7240-38-2）分别用作阳性抗生素对照和细胞毒性对照。

生物检测中使用的化学品如下：阿尔玛蓝细胞活力试剂（Alamar Blue cell viability reagent）、二甲基亚砜（DMSO）、杜氏改良 Eagle 培养基（DMEM）、胎牛血清（FBS）、青霉素-链霉素溶液（penicillin–streptomycin solution）、磷酸盐缓冲盐水（PBS）、胰蛋白酶-EDTA（trypsin–EDTA）。

Cytotoxicity assay

新型体外微孔板圆盘挥发细胞毒性检测结果显示，所有被测植物挥发物对肺成纤维细胞系MRC-5的毒性水平差异显著。Colebrookea oppositifolia 精油、异硫氰酸烯丙酯和8-喹啉醇的细胞毒性最低，其IC₅₀和IC₈₀值在最高测试浓度下（>64 μg/圆盘或>160 μg/cm³）未能检出。异硫氰酸烯丙酯和C. oppositifolia 精油在测试浓度范围内未影响细胞活力（IC₅₀ > 160 μg/cm³），而百里氢醌表现出最强的细胞毒性效应（IC₅₀ = 5.85 μg/cm³），其次是百里醌和Neolitsea cassia 精油（IC₅₀分别为7.95 μg/cm³和18.58 μg/cm³）。

Discussion

据我们所知，此前尚无文献描述任何适用于快速微孔板筛选气相挥发物细胞毒性效应的体外方法，因此可用于与我们结果进行相关比较的数据十分有限。仅有研究使用气相死亡率生物检测法评估过N. cassia 精油蒸气对Camptomyia corticalis幼虫的熏蒸毒性。与我们的结果相似，该精油表现出高毒性，在测试浓度下实现100%死亡率。然而，目前仍缺乏针对人类肺细胞系的挥发物毒性研究数据。

Conclusions

本研究设计了一种新型微孔板圆盘挥发检测法，用于体外快速筛选气相挥发物的细胞毒性和抗菌效应。该技术快速、简便、经济且高效，结合了圆盘挥发原理与标准细胞活力或肉汤微量稀释检测法（broth microdilution assays），可在商用96孔微孔板中进行，无需特殊设备。