基于复制循环反应系统（RCR）实现大片段基因组变异高效定相的新方法

为解决远距离杂合变异定相难题，研究团队开发基于复制循环反应（RCR）的创新技术，成功实现4.3–152 kb范围内变异的高精度定相，突破传统PCR与ddPCR的技术局限，为隐性遗传病基因诊断提供新方案。

　　

在遗传诊断领域，当患者在常染色体隐性遗传病相关基因中检出两个杂合变异时，明确这两个变异是否分别位于两条同源染色体上（即反式排列，形成复合杂合子）至关重要，这直接关系到致病性判定和遗传咨询。然而，传统的定相技术面临严峻挑战：亚克隆PCR或cDNA分析受限于片段长度（通常不超过10 kb）且依赖cDNA可获得性；液滴数字PCR（ddPCR）虽能将检测范围扩展至100 kb，却存在探针设计难度大、成本高等问题。这些技术瓶颈使得大片段基因组区域内的变异定相成为遗传诊断中的"灰色地带"。

为突破这一局限，来自日本东京大学医学研究生院神经内科的Akihiko Mitsutake、Hiroyuki Ishiura、Takashi Matsukawa、Jun Mitsui、Shoji Tsuji和Tatsushi Toda研究团队在《Genetics in Medicine Open》上发表研究，开发了一种基于复制循环反应（Replication Cycle Reaction, RCR）的创新定相方法。该方法巧妙利用大肠杆菌（E. coli）染色体复制原理，实现了对长达104 kb基因组片段的高效扩增和精准定相。

研究人员采用的关键技术方法包括：利用CRISPR/Cas9系统对基因组DNA进行特异性切割；将切割后的片段与含有复制起点（oriC）和氨苄抗性基因（Amp^R）的环化 cassette 连接构建环形DNA分子；通过复制循环反应（RCR）扩增目标区域；结合电泳、Sanger测序和基于转化的单等位基因分离技术进行验证。研究使用经长读长测序验证的gDNA样本进行条件优化，最终应用于7名携带4.3–152 kb间距致病变异患者的临床样本分析。

[Purpose]

研究旨在建立一种能够解决大片段基因组区域内杂合变异定相难题的新方法，突破现有技术在检测距离和操作性上的限制。

[Methods]

通过将CRISPR/Cas9切割的基因组片段与oriC–Amp^R cassette连接形成环形DNA，利用RCR系统进行扩增。优化了gDNA与cassette的比例反应条件，并通过电泳和Sanger测序验证定相准确性。最终将该方法应用于7名患者的gDNA样本，这些患者携带的致病变异间距从4.3 kb至152 kb不等。

[Results]

研究结果显示，RCR成功扩增了长达104 kb的基因组区域。当采用较低gDNA-cassette比例时，倾向于单等位基因扩增，可直接进行定相分析；而较高比例则产生双等位基因产物，需通过转化进行等位基因分离。对于间距达152 kb的变异，通过中间SNV位点实现了单倍型重建。最终在所有7例患者中均成功证实了复合杂合状态。

[Conclusion]

该研究方法能够有效实现大基因组距离范围内多个杂合变异的精准定相，为遗传诊断提供了新的技术解决方案。

研究结论与讨论部分强调，这种基于RCR的定相方法不仅克服了传统技术在大片段检测上的局限性，还展现出良好的临床应用潜力。特别是对于距离超过100 kb的变异，该方法通过引入中间SNV标记的策略成功实现了单倍型重建，这为超长距离变异定相提供了新思路。研究人员指出，单等位基因扩增的最佳条件与双等位基因扩增后的转化分离技术形成了互补方案，使方法具备更广泛的适用性。该技术平台的建立为常染色体隐性遗传病的基因诊断提供了更加可靠和高效的解决方案，有望在未来遗传诊断实践中发挥重要作用。