拟南芥dmr6 dlo1水杨酸积累突变体中生长-免疫权衡的遗传抑制因子鉴定与机制解析

本综述系统解析了拟南芥dmr6-3 dlo1-1双突变体通过水杨酸（SA）积累介导的生长-免疫权衡机制。研究者通过遗传抑制筛选发现MED15a、NPR1、ICS1/SID2和PAD4等关键基因的突变能解除SA介导的生长抑制同时保持病原体抗性，为作物抗病育种中平衡生长与免疫提供了重要靶点。

　　

遗传抑制筛选鉴定dmr6-3 dlo1-1背景中恢复生长的突变体

为研究高水杨酸水平下生长抑制的调控机制，研究团队对EMS诱变的dmr6-3 dlo1-1 M₁代植株进行正向遗传学筛选。从M₂群体中筛选出生长恢复的植株，并通过M₃代家系分析其生长和抗病表型。约65%的M₃家系表现出对Hyaloperonospora arabidopsidis（Hpa）的抗性丧失，而35%的家系在保持抗性的同时恢复了生长。生长与感病性在参考基因型中呈现正相关，但许多M₃家系偏离这种相关性，表明生长与免疫在这些家系中解耦。

七个独立M₃家系持续恢复生长但保持抗病性

通过大规模生长和抗性筛选，研究团队发现八个突变家系（来自七个M₁迷你库）表现出持续增强的生长、对Hpa的高至中度抗性以及对Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000（Pst）的高抗性。这些被称为dmr6-3 dlo1-1 zund（巨型）突变体的植株被进一步分析。zund4-1和4-2源自同一M₁迷你库且能遗传互补，证实它们为等位突变，因此后续分析仅使用zund4-1。

zund突变体的水杨酸含量及SA响应基因表达

dmr6-3 dlo1-1双突变体由于高SA积累而表现出高抗病性和生长抑制。zund突变体可能通过降低SA积累或直接抑制SA诱导的生长抑制来恢复生长。SA测量显示，部分zund突变体（zund1、4-1、5、6和7）的SA水平低于dmr6-3 dlo1-1，而其他突变体（zund2和3）的SA水平与双突变体相似。SA水平与莲座面积在参考系中显著相关，但在zund突变体中无显著相关性。

通过检测SA响应免疫相关基因（PR1和ICS1）及生长发育相关基因（ARR15、EXP3、PIF7、PRE5、TAR2和GA3OX2）的表达，发现所有zund突变体与dmr6-3 dlo1-1相比，PR1表达显著降低，ARR15和PIF7表达增强。除zund4-1外，其他突变体的ICS1表达显著降低，EXP3表达增强。基因表达模式将突变体分为与dmr6-3和dlo1-1相似（zund4-1）、与dmr6-3相似（zund2）及与野生型或dlo1-1单突变体相似（zund1、3、5、6、7）的组别。

生长-免疫权衡抑制突变体的遗传分析

M₂代才出现生长恢复表明突变是隐性且纯合后固定。通过将M₃植株与亲本dmr6-3 dlo1-1回交产生BC₁代，发现杂合子植株生长减弱，证实抑制突变是隐性的。BC₁S₁群体分离分析显示，zund1、2、3、4-1和5的生长表型符合3:1（小:大）分离比，zund7符合15:1分离比，表明这些基因型分别携带单个隐性突变或两个未连锁隐性突变。zund6显示不完全显性，其BC₁代表型中间且BC₁S₁符合1:2:1分离比。

利用BSA-seq（Bulked Segregant Analysis by Whole-Genome Sequencing）鉴定恢复生长相关的基因位点。多数突变体定位到单个遗传位点：zund1、2、3、5和7位于1号染色体，zund4-1位于3号染色体。通过选择最相关的多态性，将候选蛋白编码基因缩小至1-11个。zund6因不完全显性难以准确定位。

zund表型由MEDIATOR 15a及SA合成与感知相关基因突变引起

七个突变体中三个（zund1和zund7：med15a E90K；zund3：med15a A61T）在MED15a蛋白中存在非同义突变导致氨基酸替换。通过三个zund突变体间的遗传互补实验证实MED15a在权衡中的作用，显示E90K和A61T替换对生长抑制有相似效应。

其他zund突变体的致病基因基于已知功能在遗传连锁区域内鉴定：zund2的npr1（G504E，此前在Canet等研究中描述）和zund5的sid2（Q262*）。通过遗传互补实验验证这些突变，zund2与dmr6-3 dlo1-1 npr1-1三重突变体杂交、zund5与dmr6-3 dlo1-1 sid2-1三重突变体杂交的F₁代植株生长与野生型及亲本基因型相似，无dmr6-3 dlo1-1的生长抑制，证实zund2和zund5的恢复生长分别由NPR1的非同义替换和SID2的无义突变引起。

zund4-1中剪接缺陷影响PAD4转录本

zund4-1突变定位到PAD4（PHYTOALEXIN DEFICIENT 4）的唯一天然内含子剪接受体位点最后一个核苷酸（G1587A）。该位点高度保守，推测zund4-1存在PAD4 mRNA剪接缺陷。cDNA的PCR扩增显示多个更大产物，证实剪接缺陷，但仍存在近似野生型大小（1.3kb）的产物。测序分析发现该产物含有40核苷酸插入，源自内含子3'部分，表明使用了内含子内原始剪接受位点上游的隐性剪接受位点（A1547），导致剪接供体位点下游15核苷酸处出现提前终止密码子。PAD4蛋白首个外显子仅编码约18%蛋白，截短蛋白缺乏功能必需区域，因此zund4-1可能为无效突变。

有趣的是，pad4缺陷在dmr6-3 dlo1-1背景中恢复生长，但在野生型Col-0背景（pad4-1无效突变体）中不影响生长。该恢复生长表型是隐蔽的，仅在dmr6-3 dlo1-1背景中显现。通过基因组PAD4构建体对zund4-1进行遗传互补，部分恢复了生长抑制，但未达到亲本dmr6-3 dlo1-1水平。表达PAD4 R314A（R314A替换）的构建体未能一致恢复zund4-1生长表型。尽管R314氨基酸残基对PAD4介导的病原抗性至关重要，但这些数据表明R314在生长-免疫权衡中的作用可能部分冗余。

MED15a的KIX结构域在生长-免疫权衡中的作用

三个突变体在MED15aN端约100氨基酸的激酶诱导域相互作用（KIX）结构域发生替换。MEDIATOR复合物是高度保守的真核蛋白复合物，对转录起始至关重要。MED15尾部亚基可与多个序列特异性转录因子相互作用。KIX结构域突变或缺失损害MED15蛋白相互作用。MED15功能对生物健康至关重要，med15突变常因参与多通路而出现多效表型和发育缺陷。拟南芥和线虫中med15突变或敲低甚至导致不育。

拟南芥基因组含两个全长MED15旁系同源基因和多个截短旁系同源基因。MED15a表达最丰富且研究最多，与种子发育、毛状体形成及SA和苯并噻二唑（BTH，SA类似物）诱导响应相关。此前筛选BTH诱导生长抑制丧失也发现类似med15a KIX结构域突变（nrb4突变体）。这些相似性及近半zund突变体携带MED15a突变，表明该基因及其产物对SA或BTH响应极为重要。zund1、3和7的恢复生长结合高病原抗性水平，提示MED15a是生长-免疫权衡的重要调控因子。

SA合成、感知与信号如何影响生长-免疫权衡？

zund4-1携带PAD4剪接缺陷，导致其在dmr6-3 dlo1-1背景中生长恢复。PAD4此前未涉及生长-免疫权衡，但作为免疫中SA信号的正调控因子被广泛研究。PAD4还与干旱胁迫期间及之后植物生长调控相关，其信号伙伴EDS1（ENHANCED DISEASE SUSCEPTIBILITY 1）多次被提及与生长-免疫权衡相关。表达PAD4 R314A部分互补zund4-1生长恢复但不一致。尽管R314对PAD4介导的病原抗性必需，这些数据表明R314在生长调控中的作用可能部分依赖与EDS1的相互作用。

另两个突变体携带典型SA合成与感知相关基因突变：SID2（zund5）和NPR1（zund2）。令人惊讶的是，这些突变体在筛选恢复生长且不丧失抗性时被发现，因为npr1-1通常丧失SA诱导的Pst抗性，sid2突变体对Hpa更感病。此前描述dmr6-3 dlo1-1 sid2-1突变体具有恢复生长和对霜霉病部分抗性丧失，与中等SA水平相关。该部分抗性可能因SID2并非拟南芥SA合成唯一酶，其旁系同源酶ICS2在sid2-1突变体中仍产生SA。本研究中zund5的SA水平与野生型植株相似，可能因SA测量时间不同。不能排除这些基因型中免疫诱导SA水平不同，从而解释增强抗性表型。

尽管zund2突变npr1 G504E与此前发表npr1-42突变相似，但尚无npr1-42抗性数据发表。G504残基邻近NPR1反式激活域（残基513–533），该域结合SA并对SA诱导NPR1单体化和TGA转录因子激活至关重要。该反式激活域附近其他已发表突变（npr1 R538*和npr1 R544K）不仅丧失BTH诱导生长抑制，也丧失BTH和SA诱导的Pst细菌抗性，表明反式激活域周边区域对NPR1功能重要。需更多研究明确G504对NPR1功能及在权衡中的作用。

zund突变体揭示生长与免疫平衡的改变

本研究发现的所有zund基因此前均与SA相关，涉及SA对免疫和生长的影响。推测SA对生长抑制和免疫的效应可能存在不同剂量响应（1输入变量影响2不同输出）。拟南芥Col-0中，生长和免疫相对于内源SA水平呈现相反剂量响应曲线。dmr6/dlo1突变体表型支持此点：野生型植株低SA水平伴随高生长和低免疫，dmr6 dlo1双突变体极高SA水平导致高免疫和低生长。dmr6单突变体具有中等SA水平但双突变体样免疫和野生型样生长。因此dmr6单突变体在生长条件下似乎存在最优SA水平，导致高免疫而无重大生长惩罚。

植物对SA敏感性可能因遗传背景而异，包括整体对SA敏感性增加或降低，或对SA相对敏感性差异导致更大或更小权衡。考虑到此模型，zund突变体中权衡扰动由影响SA合成、感知或信号引起并不意外。

结束语

应用DMR6和DLO1等感病基因培育作物持久广谱抗病性可能受多效效应（如高抗突变体中生长权衡）阻碍。最小化这些多效效应的策略包括鉴定特异性影响多效性而不丧失理想表型的调控因子。基于所述差异敏感性，另一策略是通过工程化SA稳态优化植物SA水平。例如，通过DMR6或DLO1精细调控SA代谢，从而优化SA水平或延迟SA负反馈环，允许更强免疫响应。其他策略可能涉及优化SA合成或感知的工程化植物。植物变体或作物野生近缘种中存在的遗传变异可能是生成这些工程化植物的实用宝贵资源。工程化另一例证为感染诱导TBF1（TL1-BINDING TRANSCRIPTION FACTOR 1）启动子驱动优化NPR1表达，导致水稻中增强Xanthomonas oryzae pv. oryzicola和Magnaporthe oryzae抗性而无生长惩罚。生长与免疫领域未来挑战包括解析SA下游遗传网络并将科学发现转化至作物。