质体醌氧化还原状态通过RpaA与活性氧依赖调控网络影响羧酶体完整性

本研究发现蓝藻中昼夜节律代谢因子RpaA突变体在特定环境条件下会出现羧酶体（carboxysome）解体现象。研究揭示了质体醌（PQ）池过度还原（通过混合营养生长、高光或电子传递抑制剂诱导）会引发活性氧（ROS）积累，进而导致羧酶体完整性丧失，而阻止PQ过度还原的条件可逆转此过程。该发现建立了PQ池氧化还原状态与羧酶体完整性的新联系，对理解蓝藻能量平衡途径及环境适应机制具有重要意义。

　　

引言

蓝藻作为光合生物，通过多种适应途径应对光照变化。在光合线性电子流中，从水分子中提取的电子通过一系列载体（包括膜溶性质体醌（PQ）池）从光系统II（PSII）传递至光系统I（PSI）。光照突变会导致光合电子传递链（pETC）过度还原，产生活性氧（ROS）等有毒物质。状态转换和光保护系统（如橙色类胡萝卜素蛋白或黄素二铁蛋白）是蓝藻短期重新平衡pETC氧化还原状态的经典机制。

除了短期光变化，昼夜循环带来的辐照度变化由蓝藻昼夜节律机制调控。蓝藻生物钟核心振荡器KaiC通过磷酸化和去磷酸化循环运作，其上游调控器通过PQ池与光反应相连，输出功能则由双组分系统蛋白SasA和RpaA（藻胆体关联调节因子A）控制。RpaA作为OmpR型响应调节因子，是昼夜节律输出途径的主调控器，驱动基因表达的全局节律和细胞分裂门控。此外，RpaA还参与调控核心代谢酶，影响碳分配（如糖原储存与下游代谢）以及引导电子能量传递途径至下游碳代谢。

捕获的光能被下游代谢利用，尤其是集中在羧酶体中的碳固定反应。羧酶体是由蛋白质外壳包裹Rubisco的细菌微区室，是蓝藻碳浓缩机制（CCM）的核心组件。其主要功能是通过构建微环境最大化无机碳可用性，同时最小化光呼吸通量，从而增强Rubisco的碳固定能力。羧酶体通过数量、大小和空间组织的调整来响应环境变化（CO₂、光可用性、氧化还原状态、温度和光质）。近期研究发现，在模型蓝藻^{Synechococcus elongatus} PCC 7942中，辐照度增加通常与羧酶体数量增加相关，表明光能可用性与细胞对碳固定机器的投入存在调控联系。

结果

蔗糖分泌后碳固定机器的重塑需要^rpaA

研究发现RpaA功能缺失突变体（Δ^rpaA）在诱导蔗糖分泌后缺乏典型的光合活性增强（通过PSII表观量子效率^Φ_II测定）。Δ^rpaA突变体未能增加羧酶体数量和大小，而野生型（WT）通常在蔗糖分泌后表现出这些变化。在恒定光照实验室培养条件下，Δ^rpaA背景的生长速率和其他光合参数与野生型相当，尽管细胞尺寸略小。这些结果表明^rpaA缺失消除了蔗糖分泌通常观察到的光合增强和羧酶体数量增加，但在受控实验室条件下不会全局失调生长和分裂所需的基本途径。

Δ^rpaA突变体在混合营养条件下表现出生长停滞和显著的羧酶体解组装

在野生型背景中，混合营养生长轻微抑制羧酶体数量并增加羧酶体聚类。相比之下，当表达CscB允许细胞外蔗糖摄取时，Δ^rpaA菌株表现出立即的生长停滞和羧酶体重组，随后在混合营养生长开始后1-3天内发生显著的羧酶体解组装。羧酶体完整性的丧失是渐进的，部分Δ^rpaA细胞在24小时内就显示Rubisco信号在细胞质中分散，但只有部分细胞表现出完全失去羧酶体斑点。随时间推移，具有减少羧酶体斑点和增加胞质Rubisco定位的细胞比例增加，蔗糖喂养72小时后几乎所有细胞都缺乏羧酶体。

通过监测羧酶体定位蛋白McdB的动态，发现混合营养生长24小时内，内源性标记的McdB-mNG报告蛋白从羧酶体斑点中脱位。即使Rubisco核心仍存在于这些细胞中，大量细胞也表现出McdB定位完全丧失，表明羧酶体解组装可能从与壳蛋白相关的组件开始并向内进行。在对照中也观察到McdB脱位，表明Δ^rpaA细胞中的表型可能是对生长条件的夸张响应。

Δ^rpaA细胞在混合营养条件下经历严重的光合损伤

Δ^rpaA突变体在混合营养条件下的生理特征（细胞生长停滞、色素漂白和羧酶体分解）表明光合过程可能失调。通过荧光测定和光谱学直接评估在光自养和混合营养条件下培养的 cultures 的光合性能。在蔗糖喂养的Δ^rpaA菌株中，1-^q_p和1-^q_L在所有测试光照水平下均显著增加，表明PQ池在混合营养条件下所有辐照度下均过度还原。同样，表观^Φ_II在Δ^rpaA cultures 的混合营养生长下几乎降至零。

使用膜入口质谱（MIMS）解析源自光合和呼吸代谢的CO₂和O₂气体交换速率。与^q_P急剧上升和^Φ_II下降一致，在光自养和混合营养生长条件下，Δ^rpaA细胞中光合CO₂吸收迅速丧失，同时在Δ^rpaA菌株的混合营养条件下伴随O₂释放的丧失。在黑暗条件下，Δ^rpaA细胞中继续观察到CO₂呼吸，提供直接证据表明细胞在生长停滞期间保持代谢活性。然而，Δ^rpaA细胞在混合营养条件下表现出完全丧失光诱导的O₂吸收，表明积累在pETC上的还原当量未被通常将过量还原剂传递给分子氧的替代电子途径消耗。

使用活力染料SYTOX确认表现出羧酶体分解的细胞仍保持存活。荧光激活细胞分选（FACS）显示，在混合营养生长48小时后，细胞活力开始受损，72小时后没有存活细胞。这表明羧酶体解组装 initiation（即在24小时内明显）先于细胞活力丧失（在混合营养诱导的生长停滞48至72小时之间）。通过SYTOX的荧光显微镜证实了这一解释，因为显示羧酶体破坏的细胞在混合营养诱导的生长停滞24和48小时后仍为SYTOX阴性。

RpaA最近被 implication 在中央碳代谢和糖原动员的调控中。观察到蔗糖喂养导致WT和Δ^rpaA背景在最初24小时内糖原积累。然而，虽然WT背景在48小时恢复正常糖原水平，但Δ^rpaA品系随时间表现出持续的糖原积累。事实上，蔗糖喂养的Δ^rpaA细胞中的糖原超积累可通过电子显微镜直接观察到，显示糖原体在整个细胞质和类囊体膜内增殖。

PQ过度还原导致H₂O₂形成和羧酶体分解

多种胁迫因素可导致pETC内的不平衡，通常导致光保护机制的激活，包括避免ROS形成和光损伤的替代途径。在Δ^rpaA突变体中，观察到几个表明pETC中电子积累的迹象，包括1-^q_p和1-^q_L值上升，表观^Φ_II下降，以及总O₂释放的丧失。此外，在混合营养Δ^rpaA菌株中观察到的光诱导O₂吸收抑制，加上不变的P700氧化水平，表明通过细胞色素^b₆f复合体的PQ氧化可能受损，阻止电子到达PSI。

由于pETC潜在不平衡的指标，直接监测了Δ^rpaA细胞中的ROS产生，并观察到在混合营养条件开始后72小时达到峰值的ROS产生急剧增加。为了进一步解析表型，使用化学抑制剂和生长条件调节pETC的氧化还原状态。用DCMU（一种PSII抑制剂，阻断从Q_A到Q_B的电子传递，从而氧化PQ和下游电子载体）处理Δ^rpaA细胞，降低了混合营养条件下的ROS产生并防止了羧酶体分解。平行地，在黑暗中进行蔗糖喂养（光合作用不活跃）也防止了ROS产生并保留了羧酶体完整性。相比之下，用DBMIB（被认为阻断从PQ到细胞色素b₆f的电子传递）处理并未拯救蔗糖喂养的Δ^rpaA细胞，这些细胞继续强烈产生ROS并表现出羧酶体分解。黑暗和DCMU处理也恢复了在混合营养Δ^rpaA细胞中通常观察到的细胞活力和色素沉着丧失。

过氧化氢（H₂O₂）是一种主要的ROS形式，在植物中具有已确立的信号作用，尽管在蓝藻中任何保守的调控功能尚未明确建立。因此测试了H₂O₂的直接应用，观察到这种处理也影响WT和Δ^rpaA菌株的细胞色素沉着和羧酶体完整性。有趣的是，Δ^rpaA突变体在细胞活力、色素沉着和羧酶体完整性方面对外部添加H₂O₂表现出增加的敏感性。急性H₂O₂处理（WT为2 mM H₂O₂或Δ^rpaA为750 μM H₂O₂）导致在最初24小时内快速漂白和大多数羧酶体分解。在亚急性H₂O₂处理（WT为1 mM或Δ^rpaA为400 μM）下，细胞未表现出生长的实质性变化或色素沉着。然而，在亚急性H₂O₂处理后立即数小时内，观察到羧酶体数量和RbcS-mNG斑点组织的细微改变。关键的是，在后期时间点（H₂O₂暴露后36-72小时），羧酶体表型似乎加剧，群体中许多细胞显示羧酶体亮度异质性、错位/极向羧酶体斑点、羧酶体太少或根本没有羧酶体斑点。

导致ROS生成的生理条件与羧酶体重排相关

接下来询问除了混合营养生长之外，其他生理相关环境条件是否与羧酶体解组装相关，并监测了与氧化还原不平衡和ROS产生的任何相关性。光和无机碳可用性是强烈影响蓝藻光合性能和ROS产生的两个关键环境因素。因此，重新访问了在环境CO₂条件下的WT和Δ^rpaA细胞，同时改变光强度（HL，150 μmol photons m^?2 sec^?1；LL，17 μmol photons m^?2 sec^?1）和蔗糖喂养。在环境CO₂水平和HL下，发现Δ^rpaA即使在没有蔗糖喂养的情况下也显示出 substantial 羧酶体分解。环境CO₂本身不足以诱导Δ^rpaA细胞中的羧酶体解组装，因为在LL条件下，光自养和混合营养条件下羧酶体都保持良好。还检测到ROS积累增加，在光自养条件下在HL和LL下都比混合营养条件下更明显，尽管在空气下所有测试 cultures 中检测到的ROS绝对值 substantially 高于3% CO₂。有趣的是，混合营养生长部分拯救了在环境CO₂和HL下Δ^rpaA细胞中羧酶体的丧失。在每种情况下，升高的ROS与羧酶体解组装以及叶绿素含量和细胞活力密切相关，尽管在这些条件下未观察到生长停滞。

讨论

研究发现建立了光合氧化还原状态与羧酶体完整性之间的新调控联系，部分由转录因子RpaA介导。结果进一步强调了RpaA在蓝藻细胞氧化还原平衡和中央碳代谢关键步骤调控中的新兴作用。此外，确定了RpaA在不同生长模式（例如，光自养到混合营养）之间转换的新功能，特别是在动态条件下蓝藻ROS生产方面。

Δ^rpaA突变体中异常的羧酶体调控与ROS积累相关

研究发现Δ^rpaA突变体在PQ过度还原和相关ROS形成条件下显示 dramatic 羧酶体重组和解组装。在混合营养下，Δ^rpaA突变体表现出延长的PQ过度还原和H₂O₂生成，导致近完全羧酶体分解。显著地，通过限制光合PQ还原的条件（包括DCMU、低光或黑暗）可以防止这种分解。类似地，在消除导致pETC过度还原的胁迫源后，细胞中可以重新形成羧酶体。此外，直接H₂O₂应用在体内引发羧酶体分解，表明这种ROS足以引发表型。最后，Δ^rpaA突变体也未能进行在已知调节羧酶体形态的生长条件下更细微的重排。在稳态条件下，它们显示升高的Rubisco含量和增加的羧酶体数量。此外，在激活异源蔗糖库后观察到的羧酶体丰度、Rubisco含量和CO₂固定的增加在Δ^rpaA背景中被废除。

观察到的羧酶体表型是新颖的，因为蓝藻通常表现出这些微区室的组成型组装。据我们所知，文献中仅在两种其他背景下报道过羧酶体分解。首先，在蓝藻活细胞成像研究中，经过基因工程改造逐渐耗尽羧酶体结构组件，降解的羧酶体首先从核样体错位到细胞极，然后Rubisco核心溶解，缺乏完整的壳结构。这种羧酶体生命周期的可视化与我们观察到的在Δ^rpaA突变体中 precede 羧酶体损失的错位、极向Rubisco斑点平行。其次，在^{Microcystis aeruginosa}中记录了部分羧酶体解组装，其中毒素微囊藻素结合Rubisco并 disrupts 其封装，导致Rubisco从羧酶体脱位至类囊体相关聚集体。有趣的是，微囊藻素还通过抑制硫氧还蛋白和过氧化物酶 sensitizes ^{M. aeruginosa} to H₂O₂，表明ROS积聚也伴随微囊藻素暴露后Rubisco的脱位。

在Δ^rpaA细胞中观察到的羧酶体解组装的确切机制仍不清楚，尽管先前的证据表明H₂O₂诱导的氧化可能损害羧酶体完整性。许多蛋白质包含氧化还原反应特征，如半胱氨酸残基，在ROS积累期间检测和转导细胞氧化还原状态的变化。这些特征现在在蓝藻羧酶体的几个核心组件中得到认可， highlighting 氧化还原调控在羧酶体组装中日益增长的认识。更具体地，新的羧酶体已显示拥有还原的内腔，在其成熟过程中变得更加氧化。例如，支架蛋白CcmM和CcmN，以及货物蛋白Rubisco和碳酸酐酶（CcaA），包含受氧化还原控制的半胱氨酸。CcmM半胱氨酸的氧化降低了其对Rubisco的亲和力，破坏了生物发生所需的缩合步骤。类似地，RbcL和CcaA中的半胱氨酸氧化抑制了它们的酶活性，并且在RbcL的情况下促进降解。Rubisco本身可能被ROS氧化和抑制，与CO₂同化的急剧下降一致。因此，在混合营养下Δ^rpaA突变体中升高的ROS可能阻碍新的羧酶体生物发生，直到氧化剂水平降低。

一种可能的解释是，PQ还原和相关ROS形成是蓝藻用于响应环境变化重塑羧酶体的调控机制的一部分。羧酶体的大小、数量和亚基组成已知与光强度和CO₂水平相关。在一个特别相关的例子中，在高光诱导的羧酶体数量增加在^{S. elongatus}中被DCMU部分阻断。也 well established 高光或低CO₂可过度还原PQ池并产生ROS。数据扩展了先前的出版物，表明PQ依赖性羧酶体重塑可能是源自该氧化还原载体过度还原的ROS（可能是H₂O₂）的功能，尽管不能排除其他潜在的ROS来源（例如，PSII中的电荷重组）。在这种背景下，H₂O₂——无论是来自光呼吸还是直接应用——最近被显示调节藻类 pyrenoid，促进更紧密的Rubisco聚集和更明确的淀粉鞘。虽然推测，数据暗示H₂O₂可能类似地在蓝藻中充当信号或调控角色，连接pETC氧化还原状态与CCM重组。

RpaA功能平衡细胞氧化还原和碳分配

RpaA作为蓝藻转录的主调控器具有已确立的作用，使得难以将我们在Δ^rpaA突变体中观察到的增加的ROS产生归因于单一原因或途径。尽管如此，最近的报告强调至少两个与观察密切相关的关键RpaA调控输出：氧化还原平衡的调节和中央碳代谢中分配的 control。Δ^rpaA突变体可能容易受到氧化还原失衡的一种方式是它们缺乏硫氧还蛋白（TrxA），这是减少2-Cys过氧化物酶（TpxA）中半胱氨酸所必需的。TpxA是^{S. elongatus}中负责解毒ROS（包括H₂O₂）的主要酶，并且先前已被显示在光混合营养生长条件下上调。更直接地，最近在 proximity 标记研究中显示TpxA和过氧化氢酶-过氧化物酶（KatG）与RpaA富集，表明可能的直接RpaA相互作用，需要进一步研究。

Δ^rpaA突变体中明显的氧化还原敏感性可能通过改变的代谢分配而进一步加剧，如在RpaA缺陷细胞在光/暗循环下生长时活力丧失的充分描述的情况下。这种暗诱导的活力丧失被认为是由于“氧化还原危机”，其中Δ^rpaA突变体未能既在白天路由足够的碳 towards 糖原储存，又表现出在夜间从糖原解放碳的能力减少；这使得Δ^rpaA细胞缺乏NADPH用于黑暗中的ROS解毒。确实，糖原是在许多背景下的重要代谢缓冲器，在胁迫或营养缺陷期间充当光合代谢的“汇”，并需要快速补充碳水化合物中间体以在环境波动期间有效“重启”Calvin-Benson-Bassham（CBB）循环。因此，不当的糖原调控可能导致多种背景下的源/汇不平衡，这些背景被记录在许多绿色谱系物种中与光抑制和ROS产生相关。

基于已确立文献的另一种解释是，RpaA可能具有更直接感知细胞氧化还原状态或PQ池的能力。例如，CikA是一种昼夜节律输入激酶，直接感知醌池氧化还原状态，并且还调节RpaA的磷酸化状态。LdpA是另一种结合RpaA的昼夜节律蛋白，并拥有一个 proposed 受细胞氧化还原调节的铁硫簇。进一步的报告通过体外实验将RpaA与pETC的氧化还原状态通过铁氧还蛋白（Fd）和硫氧还蛋白（TrxA）的相互作用连接起来。最后，RpaA中的氧化还原响应半胱氨酸已被显示受TrxA调节，这些残基的还原状态影响RpaA寡聚状态。鉴于RpaA的Cys65的氧化还原状态最近被报道在体内经历光依赖性循环，因此RpaA功能可能更直接地通过与氧化还原伙伴的相互作用被修改。未来的工作将需要解析RpaA被细胞氧化还原状态调节的机制。

总之，提出了一个临时模型，其中RpaA在连接细胞氧化还原状态（尤其是PQ池）与羧酶体组织和功能方面发挥作用。跨多项研究的一个新兴主题暗示，当 challenged 过渡 across 各种环境（例如，昼/夜、高光）或代谢（例如，光养/混合营养、碳固定/呼吸） regime 时，RpaA缺陷细胞容易发生能量平衡失调。此外，由于RpaA在调节代谢氧化还原池、解毒ROS和/或控制替代pETC电子传递途径中的作用，Δ^rpaA突变体可能 primed 在此类过渡期间过度产生ROS。假设在PQ过度还原条件下观察到的H₂O₂ prolonged burst 可能氧化羧酶体的关键结构组件，抑制新的羧酶体生物发生并随时间 destabilize 现有的羧酶体。尽管与先前报道的Δ^rpaA突变体中糖原缺乏不同，但混合营养条件下的糖原超积累进一步强调了RpaA缺陷系中中央碳代谢分配的失调。

集体地，数据指向PQ池的额外调控角色，连接到碳固定机器在过渡时期（可能存在光反应和暗反应之间不匹配）的完整性和/或重塑。这种控制似乎涉及RpaA，揭示了在蓝藻实现能量平衡中PQ和RpaA多层面调控的先前未被充分认识的功能。