基于TMT定量蛋白质组学揭示文蛤免疫活性肽通过调节细胞骨架与代谢通路改善大鼠自身免疫性前列腺炎的作用机制

本研究针对慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征(CP/CPPS)缺乏有效治疗手段的临床难题，系统探讨了文蛤(Meretrix meretrix Linnaeus)源免疫活性肽(MLIP)的干预效果与作用机制。通过建立大鼠自身免疫性前列腺炎模型，结合TMT标记定量蛋白质组学技术，发现MLIP能显著改善前列腺组织病理损伤，降低TNF-α、IL-6、IL-1β等炎症因子表达，并鉴定出245个差异表达蛋白。生物信息学分析揭示这些蛋白主要富集于肌细胞骨架、糖酵解、运动蛋白和氨基酸生物合成等通路，表明MLIP通过调控组织结构和代谢过程发挥治疗作用。该研究为开发海洋源活性肽治疗自身免疫性前列腺炎提供了新的理论依据和潜在治疗策略。

　　

在男性泌尿系统疾病中，前列腺炎是最常见的困扰之一，尤其慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征(CP/CPPS)占据了90%以上的病例。这种疾病不仅表现为排尿异常和局部疼痛，更重要的是其发病机制复杂，涉及自身免疫反应和局部炎症过程。目前临床上常用的非甾体抗炎药(NSAIDs)虽能缓解症状，但无法从根本上解决问题，因此寻找具有免疫调节和抗炎活性的天然产物成为研究热点。

海洋生物作为生物活性物质的宝库，近年来受到越来越多关注。文蛤(Meretrix meretrix Linnaeus, MML)是一种常见的海洋双壳类生物，在亚洲沿海地区广泛分布。先前的研究表明，文蛤提取物具有抗氧化、抗肿瘤和免疫增强等多种生物活性，但其在自身免疫性前列腺炎治疗中的潜在价值尚未被充分探索。特别是文蛤来源的免疫活性肽(MLIP)是否能够调节前列腺组织的炎症反应，以及通过何种分子机制发挥作用，这些都是值得深入研究的科学问题。

为了解决这些问题，来自鲁东大学食品工程学院的研究团队开展了一项系统性的研究，相关成果发表在《Journal of Agriculture and Food Research》上。研究人员首先从文蛤中制备了免疫活性肽(MLIP)，并对其分子量分布和氨基酸组成进行了详细表征。随后，他们建立了大鼠自身免疫性前列腺炎模型，通过组织病理学检查、炎症因子检测和蛋白质组学分析等手段，全面评估了MLIP的治疗效果和作用机制。

在研究技术方法方面，作者主要采用了以下几个关键技术：首先通过复合蛋白酶酶解法制备文蛤免疫活性肽(MLIP)，并利用高效液相色谱(HPLC)分析其分子量分布和氨基酸组成；其次使用纳米液相色谱-串联质谱(nLC-MS/MS)技术鉴定肽段序列；接着通过大鼠自身免疫性前列腺炎模型（使用纯化前列腺蛋白与弗氏完全佐剂诱导）进行体内药效评价；最后采用TMT标记的定量蛋白质组学技术分析前列腺组织中的差异表达蛋白，并通过Western blot对关键蛋白进行验证。所有动物实验均使用Sprague-Dawley(SD)大鼠，实验方案经鲁东大学机构审查委员会批准。

3.1. MLIP的特征分析

研究人员首先对MLIP的理化特性进行了全面分析。结果显示，MLIP中91.33%的肽段分子量分布在100-3000 Da之间，这一范围的肽段通常具有较好的生物利用度和免疫调节潜力。氨基酸组成分析表明，谷氨酸(Glu)、丙氨酸(Ala)、天冬氨酸(Asp)和亮氨酸(Leu)是主要组成成分，其中疏水性氨基酸占总量的38.30%，免疫活性氨基酸占28.60%。此外，必需氨基酸含量超过35%，表明MLIP具有较高的营养价值。

通过nLC-MS/MS分析，研究人员从MLIP中鉴定出58个独特肽段，这些肽段来源于19种母体蛋白，分子量范围在529.65-1873.39 Da之间，包含5-15个氨基酸残基。值得注意的是，98.28%的肽段含有至少一个疏水性氨基酸，45个肽段含有带负电荷的残基如谷氨酸(E)和酪氨酸(Y)，这些结构特征可能影响肽段的稳定性和与免疫受体的相互作用。

3.2. MLIP干预对自身免疫性前列腺炎的影响

动物实验结果显示，自身免疫性前列腺炎模型成功建立，模型组大鼠前列腺组织出现明显的炎症细胞浸润、腺体萎缩和结构损伤。经过MLIP干预后，大鼠体重得到恢复，高剂量MLIP组(400 mg/kg/d)体重接近正常对照组。组织学检查表明，MLIP治疗组前列腺组织病理损伤明显改善，腺体萎缩程度减轻，炎症症状显著缓解。

器官指数分析显示，模型组大鼠前列腺出现萎缩，而MLIP治疗组和阳性对照组(celecoxib)前列腺重量与正常组无显著差异，其他主要器官(肝、脾、肾)的器官指数也保持正常，表明MLIP具有良好的安全性。

3.3. MLIP对前列腺损伤和促炎细胞因子水平的影响

组织病理学评估进一步证实了MLIP的治疗效果。正常对照组前列腺组织结构完整，腺腔清晰，上皮层完好；而模型组出现明显的腺体萎缩、上皮增生和腺泡结构紊乱。MLIP治疗组表现出不同程度的组织修复，炎症症状明显改善。

炎症等级评估显示，模型组和低剂量MLIP组(200 mg/kg/d)炎症损伤严重，而高剂量MLIP组和阳性对照组炎症明显减轻。细胞因子检测发现，模型组前列腺组织中TNF-α、IL-6和IL-1β水平显著升高，MLIP干预后这些促炎因子呈剂量依赖性下降，其中TNF-α从199.09 pg/g降至149.27 pg/g。值得注意的是，血清中这些细胞因子水平在各组间无显著差异，表明炎症反应主要局限于前列腺组织。

3.4. 蛋白质组学分析和富集分析

TMT定量蛋白质组学分析揭示了MLIP治疗的分子机制。研究人员共鉴定出245个差异表达蛋白(DEPs)，其中193个上调，52个下调。基因本体(GO)富集分析显示，这些蛋白主要参与系统过程、肌肉结构发育和肌肉系统过程等生物过程；在细胞组分方面，主要与超分子聚合物、超分子纤维和超分子复合物相关；在分子功能方面，主要涉及细胞骨架蛋白结合、肌动蛋白结合和分子功能调节活性。

KEGG通路分析发现了27个显著富集的信号通路，其中最显著的是"肌细胞中的细胞骨架"通路(38个蛋白，p=3.49×10^-18)、"糖酵解/糖异生"通路(12个蛋白，p=1.19×10^-6)、"运动蛋白"通路(15个蛋白，p=2.40×10^-5)和"氨基酸生物合成"通路(12个蛋白，p=2.60×10^-5)。这些结果表明MLIP可能通过调节细胞骨架结构、能量代谢和生物合成过程来发挥治疗作用。

3.5. Western blot验证差异表达蛋白

为了验证蛋白质组学结果，研究人员选择了4个代表性蛋白进行Western blot分析：原肌球蛋白1(TPM1)、肌钙蛋白T3(Tnnt3)、磷酸甘油酸激酶(PGK)和烯醇化酶3(ENO3)。这些蛋白分别参与细胞骨架、运动蛋白、糖酵解和氨基酸生物合成等关键通路。结果显示，MLIP治疗组中这4种蛋白的表达水平均显著上调，与蛋白质组学数据一致。

TPM1和Tnnt是肌细胞细胞骨架的关键结构成分，它们的上调可能增强细胞骨架完整性，促进组织修复，并抑制炎症介导的结构破坏。PGK是糖酵解途径中的关键酶，其表达增加可能增强糖酵解通量，为组织修复提供能量和生物合成前体。ENO3是一种多功能蛋白，参与糖酵解、细胞骨架重组和氨基酸生物合成，其过表达可能同时支持能量代谢和结构完整性。

这项研究首次全面评估了文蛤源免疫活性肽(MLIP)在自身免疫性前列腺炎大鼠模型中的干预效果和分子机制。研究结果表明，MLIP能够显著改善前列腺组织病理损伤，降低局部促炎细胞因子表达，并通过调节细胞骨架结构、能量代谢和生物合成过程促进组织修复。

从机制角度来看，MLIP可能通过多种途径发挥治疗作用：一方面通过上调细胞骨架相关蛋白(如TPM1、Tnnt3)增强组织结构完整性，抑制炎症细胞浸润；另一方面通过调节代谢相关蛋白(如PGK、ENO3)增强能量供应和生物合成能力，支持组织修复过程。这些发现为理解海洋源活性肽在自身免疫性疾病治疗中的作用提供了新的视角。

该研究的重要意义在于：首先，它证实了文蛤源免疫活性肽在治疗自身免疫性前列腺炎方面的潜在价值，为开发海洋源天然产物治疗炎症性疾病提供了实验依据；其次，通过整合多组学技术，系统揭示了MLIP的作用机制，发现了多个潜在的治疗靶点；最后，这些发现不仅适用于前列腺炎，也可能为其他自身免疫性和炎症性疾病的治疗提供新的思路。

然而，研究也存在一些局限性，如需要进一步开展机制研究确认这些差异表达蛋白在慢性前列腺炎中的具体功能，以及评估它们作为治疗靶点的潜力。未来的研究可以重点关注这些蛋白在炎症信号通路中的具体作用，以及MLIP如何通过调节这些蛋白来影响免疫细胞功能和组织修复过程。

总的来说，这项研究为开发文蛤源免疫活性肽作为慢性前列腺炎/慢性盆腔疼痛综合征的治疗策略提供了重要的理论基础和实验证据，展现了海洋生物活性肽在免疫调节和抗炎治疗中的广阔应用前景。