青光安II号方通过抑制TRPV4/NF-κB信号通路减轻青光眼视网膜神经节细胞焦亡

本研究针对青光眼性视神经病变中视网膜神经节细胞进行性丢失的难题，探讨了中药复方青光安II号（QGAII）的保护作用及机制。研究人员通过体内外实验证实，QGAII通过靶向调控TRPV4/NF-κB信号通路，显著抑制RGC焦亡（pyroptosis），改善视网膜结构和功能。该研究为中医药治疗青光眼提供了新的分子机制依据，为开发神经保护策略提供了重要方向。

　　

青光眼是全球首位不可逆性致盲眼病，其核心病理改变是视网膜神经节细胞（Retinal Ganglion Cells, RGCs）的进行性凋亡和视神经纤维的丢失。青光眼性视神经病变（Glaucomatous Optic Neuropathy, GON）患者即使通过药物或手术有效控制了病理性高眼压（pathological high intraocular pressure, ph-IOP），视功能损害仍可能持续进展。这表明，除了降低眼压，寻找能够直接保护RGC、延缓甚至逆转视神经损伤的新疗法，已成为青光眼研究领域的焦点和难点。

近年来，程序性细胞死亡的新形式——焦亡（pyroptosis），一种伴随剧烈炎症反应的细胞死亡方式，在GON的发病机制中逐渐受到关注。研究表明，在青光眼模型中，RGC的死亡形态呈现出明显的焦亡特征，同时视网膜中焦亡标志物分子显著升高。另一方面，瞬时受体电位香草素亚型4（Transient Receptor Potential Vanilloid 4, TRPV4）作为一种对机械刺激（如眼压升高）敏感的非选择性阳离子通道，在RGC表面大量表达。其持续激活会导致钙离子（Ca²⁺）内流，直接引发细胞死亡。新近研究还发现，TRPV4的激活能进一步启动核因子κB（Nuclear Factor-κB, NF-κB）相关通路，后者作为经典的炎症通路，在GON的免疫异常中扮演重要角色，并可能最终介导焦亡的发生。

源于临床实践的中药复方青光安II号 decoction (QGAII) 由枸杞子、黄芪、川芎、牛膝、女贞子、灯盏细辛六味中药组成，拥有数十年的临床应用历史，被证实能促进视神经修复、保护青光眼患者视野。临床前研究也表明该方能通过多途径保护视网膜组织、减少RGC死亡。研究团队此前发现，QGAII能在青光眼动物模型中调控视网膜TRPV4的表达，但其精确的神经保护机制尚不完全清楚。

为了深入探索QGAII是否通过调控TRPV4/NF-κB通路来抑制RGC焦亡，从而发挥 optic neuroprotection (视神经保护) 作用，研究人员开展了一项综合性研究，成果发表在《Journal of Ethnopharmacology》上。

本研究采用了多层次的研究策略，关键技术方法包括：利用自发性高眼压DBA/2J小鼠作为体内动物模型；创新性地构建了体外细胞损伤模型，将连续静水压（Continuous Hydrostatic Pressure, CHP）与氧糖剥夺（Oxygen-Glucose Deprivation, OGD）相结合以模拟青光眼的“机械应激”和“血管缺血”双重病理刺激；运用了包括苏木精-伊红（H&E）染色、透射电镜（TEM）、扫描电镜（SEM）、免疫荧光、流式细胞术、蛋白质免疫印迹（WB）、实时定量聚合酶链反应（qPCR）和酶联免疫吸附测定（ELISA）在内的多种技术手段；并通过脂质体转染技术对TRPV4、NF-κB和GSDMD等关键基因进行了沉默和过表达操作，以验证其功能。

3.2.2. QGAII对慢性ph-IOP模型视网膜中的RGCs具有保护作用，其机制与减少RGC焦亡有关

通过H&E染色和TEM观察发现，QGAII干预改善了DBA/2J小鼠视网膜的形态结构，增加了RGC数量，并显著改善了模型组中出现的细胞膜破裂、核肿胀等焦亡特征性超微结构。这表明QGAII在该模型中对RGCs具有保护作用，且该作用与减轻RGC焦亡相关。

3.2.3. QGAII可减轻慢性ph-IOP模型视网膜中的RGC焦亡，这可能与调节TRPV4/NF-κB信号通路有关

流式细胞术检测发现模型组视网膜细胞内Ca²⁺含量显著升高，而QGAII干预可逆转这一变化。免疫荧光、qPCR和WB结果一致表明，模型组中TRPV4、NF-κB通路关键分子（IKKβ、IκBα、P65）及其磷酸化蛋白水平，以及焦亡关键执行蛋白GSDMD和下游炎症因子IL-1β、IL-18的表达均显著上调，而QGAII治疗能剂量依赖性地抑制这些分子的表达。这些结果提示，QGAII的保护作用可能是通过调控TRPV4/NF-κB信号通路来实现的。

3.3.2. CHP联合OGD构建的R28细胞损伤模型表现出GSDMD依赖性焦亡

研究人员成功优化并建立了CHP（150 mbar）联合OGD（含10% FBS的无糖培养基）的R28细胞损伤模型，该模型细胞活力降至IC50附近。通过基因操作证实，抑制GSDMD表达可抵抗这种损伤，而过表达GSDMD则加剧细胞死亡。SEM观察到模型组细胞出现大量焦亡体和细胞膜破裂。在分子水平，模型组GSDMD、GSDMD-N、caspase 1、IL-1β、IL-18等焦亡相关指标均显著升高。这证实该模型诱导的细胞死亡形式是GSDMD介导的焦亡。

3.3.3. CHP联合OGD构建的R28细胞损伤模型与调控TRPV4/NF-κB通路导致焦亡有关

通过基因功能获得和缺失实验发现，过表达TRPV4或NF-κB均能诱导细胞死亡和焦亡形态，并激活完整的TRPV4/NF-κB/焦亡通路分子表达。关键的是，在TRPV4沉默的基础上过表达NF-κB，仍能诱导焦亡；而在TRPV4过表达的同时沉默NF-κB，则可有效缓解焦亡。这表明在R28细胞中，TRPV4位于NF-κB的上游，并可能以“主开关”的形式单向调控NF-κB通路，进而诱发焦亡。

3.4.1. QGAII通过抑制TRPV4/NF-κB信号通路减轻CHP联合OGD引起的R28细胞焦亡

毒性试验表明QGAII在低于5%浓度下对R28细胞无毒性。药理实验发现QGAII干预能浓度依赖性地提高损伤模型下的细胞活力，减少死亡细胞比例，SEM显示细胞焦亡形态得到改善。机制研究表明，QGAII能降低细胞内Ca²⁺浓度，并下调TRPV4、NF-κB通路相关蛋白及焦亡标志物（GSDMD, caspase 1, NLRP3, ASC, IL-1β, IL-18）的基因和蛋白表达水平。这从分子层面证实QGAII通过抑制TRPV4/NF-κB信号通路来减轻R28细胞焦亡。

3.4.2. QGAII减轻CHP联合OGD引起的小鼠原代RGC死亡可能也与抑制TRPV4/NF-κB信号通路引起的焦亡有关

为增强结果可信度，研究在小鼠原代RGCs中重复了关键实验。结果表明，基于R28细胞建立的建模和干预条件同样适用于原代RGCs，且QGAII保护原代RGCs的分子机制与在R28细胞中观察到的完全一致，即通过抑制TRPV4/NF-κB信号通路减轻细胞焦亡。

本研究得出结论：中药复方青光安II号（QGAII）能够通过抑制TRPV4离子通道的活性，减少Ca²⁺内流，进而下调下游NF-κB信号通路的活化，最终显著减轻青光眼模型中视网膜神经节细胞（RGC）的焦亡（pyroptosis），发挥有效的视神经保护作用。该研究不仅首次在青光眼研究中将TRPV4、NF-κB信号通路与RGC焦亡这三个关键环节联系起来，阐明了QGAII发挥神经保护作用的新分子机制，为中医药治疗青光眼提供了坚实的现代科学依据；同时，研究所创新的CHP联合OGD体外细胞模型更好地模拟了青光眼复杂的病理生理环境，为后续药物筛选和机制研究提供了有价值的工具。TRPV4作为调控上游的“主开关”，其作为青光眼靶向治疗潜在关键靶点的价值也在此研究中得以凸显，为未来开发新的神经保护策略指明了方向。