基于微型化聚乙二醇沉淀法评估商业化及临床阶段单抗与双特异性抗体的高浓度行为相关性研究

本研究针对生物药早期开发中因样品量限制而难以直接表征蛋白溶解性的难题，开发了一种微型化高通量PEG沉淀（mini-PEG）筛选方法。研究人员通过测定多种单克隆抗体（mAbs）和双特异性抗体在PEG-3350溶液中的相分离温度（Tcloud），建立了表观溶解性排序体系。结果表明该方法仅需微克级样品即可有效预测生物制剂在无PEG配方中的溶解性行为，且与粘度、kD参数等溶液行为具有相关性。该技术为早期候选药物可开发性评估提供了重要工具，对推动高浓度蛋白制剂开发具有重要意义。

　　

在生物制药领域，单克隆抗体（mAbs）和双特异性抗体等大分子 therapeutics 的皮下给药方式正日益受到青睐。这种给药途径不仅能提升患者用药便利性，还能改善治疗依从性。然而，皮下注射严格限制注射体积（通常不超过1.5mL），这就要求蛋白药物必须能在极高浓度（往往超过100mg/mL）下保持稳定溶液状态。因此，高蛋白溶解性成为皮下给药制剂的关键质量属性。

但现实挑战在于：早期药物开发阶段样品量极其有限，传统溶解性测定方法（如超滤浓缩至出现浊度）需要克级蛋白样品，这使直接表征变得不切实际。更复杂的是，蛋白溶解性受多种因素影响，包括分子间相互作用、配方条件（pH值、缓冲液类型、离子强度）、温度等，使得预测和优化变得困难重重。

为解决这一难题，AbbVie生物研究中心的科研团队开展了一项创新研究，他们开发了一种微型化高通量聚乙二醇沉淀（mini-PEG）筛选方法，只需微克级样品就能评估生物药物的相对溶解性。这项研究成果正式发表在《Journal of Pharmaceutical Sciences》上，为早期药物开发提供了强有力的工具。

研究人员采用了几项关键技术方法：首先建立了微型化PEG沉淀实验平台，使用Nimble Jr.^TM系统在96孔板中对含PEG-3350的蛋白样品进行降温扫描（从38°C至0°C，速率1°C/min），通过490nm透光率变化测定相分离温度（T_cloud）；同时采用动态光散射（DLS）测量扩散相互作用参数k_D，使用Viscosizer TD测定高浓度（100mg/mL）下的粘度，并通过UV-Vis光谱在350nm处测量溶液浊度（OD350）；还利用尺寸排阻色谱（SE-UPLC）定量分析40°C加速应激3周后的高分子量物种（HMW）变化。研究样本包括15种商业化或临床阶段抗体，其中7种单克隆抗体和8种双特异性抗体，部分为商业采购，部分为内部CHO细胞系表达。

PEG-3350浓度对区分不同名义溶解度mAbs的影响

通过测试10%-30%（w/v）PEG-3350浓度范围，发现20%浓度最能有效区分不同溶解性的单克隆抗体。过高浓度（30%）因溶液粘度过大引入测量噪声，过低浓度（≤15%）则无法诱发足够的相分离。研究人员将T_cloud值分为三类：≤0°C代表高表观溶解性，38°C（初始相对强度低于30%）代表低表观溶解性，中间值为中等。该方法与无PEG条件下100mg/mL浓度测量的名义溶解性（OD350）高度一致。

mAbs和双特异性抗体mini-PEG法表观溶解性与其它溶液行为的相关性

研究发现表观溶解性排序与其它溶液性质（k_D、聚集倾向性、高浓度浊度）总体相关，但并非完全一致。对于mAbs，无论IgG亚型如何，高表观溶解性分子（如Golimumab和Denosumab）都表现出低粘度、正k_D值和低聚集倾向；而中等表观溶解性分子（如Evolocumab和Bevacizumab）则表现出中等浊度和较高的聚集倾向。双特异性抗体虽然分子构型多样（包括IgG-scFv、VHH-VHH-Fc、Crossmab等），但表观溶解性仍与总体溶液行为强相关。例外的是APVO-436，因其构象稳定性低（T_{m_onset}仅48.7°C），与PEG存在优先相互作用，导致表观溶解性与名义溶解性不一致。

相关性矩阵分析显示，表观溶解性和名义溶解性都与k_D和等电点（pI）呈强正相关，说明表面电荷在分子间相互作用中起关键作用。粘度和溶解性是不同的溶液行为，虽然都与k_D相关。分子量（MW）和熔解温度起始点（T_{m_onset}）与任何参数均无相关性，而聚集倾向性（ΔHMW%）受多种机制影响，未显示简单相关性。

使用mini-PEG沉淀法研究配方对NISTmAb和mAb2表观溶解性的影响

以NISTmAb为模型蛋白，在10%PEG-3350条件下测试了24种不同配方（pH4.5-8.0，多种缓冲液）。发现表观溶解性随pH接近蛋白等电点（pI～9.2）而降低，符合胶体机制。缓冲液种类也显著影响结果：在pH4.5时，柠檬酸盐缓冲液的表观溶解性最低，可能因多价羧酸离子的电荷屏蔽效应减弱了蛋白间排斥相互作用。磷酸盐缓冲液也比组氨酸缓冲液降低溶解性，说明特定缓冲液成分与蛋白表面的结合可能调节分子间相互作用。

对溶解性差的mAb2的研究发现，在pH6（接近其pI～6.8）时，由于表面电荷不足和局部各向异性吸引作用，表现出高浊度和相分离。增加离子强度（75mM NaCl或Arg-HCl）可通过屏蔽静电相互作用改善溶解性。精氨酸盐酸盐（Arg-HCl）比NaCl效果更好，可能因为其通过阳离子-π相互作用与暴露的疏水区域优先作用，稳定天然构象。mini-PEG法在7.5%和10%PEG浓度下都能检测到这种改善，且比浊度测量更灵敏。

研究结论表明，微型化PEG沉淀法是一种高效、灵敏的溶解性排序工具，只需微克级样品即可评估生物候选药物及其配方的溶解性。表观溶解性（T_cloud）与无PEG条件下的名义溶解性总体一致，且与其它蛋白自相互作用驱动的溶液行为相关。该方法不仅能对特定配方中的蛋白进行溶解性排序，还能筛选优化配方条件（如pH、缓冲液种类、离子强度、添加剂）。尽管存在少数例外（主要由构象稳定性或与PEG的特异性相互作用引起），mini-PEG法在早期可开发性评估中具有重要价值，特别适用于样品量有限的发现候选药物和配方开发阶段。

这项研究的重要意义在于为解决生物药开发中的关键瓶颈——早期阶段溶解性评估难题提供了实用方案。通过建立微型化、高通量的筛选平台，研究人员能够在药物开发最早阶段识别出具有理想溶解性特征的候选分子，避免后期开发中的配方难题。同时，该方法还能指导配方优化，通过系统筛选pH、缓冲液、添加剂等条件，找到最佳配方方案。对于双特异性抗体等复杂分子，该方法显示了良好的适用性，这对推动下一代生物治疗药物的发展具有重要意义。最终，这项技术将有助于加速高质量生物药物的开发，为患者提供更便捷、有效的治疗选择。