基于尺寸排阻色谱的香肠模型亚硝酸盐残留分析新方法与添加水平优化研究

本文针对加工肉制品中亚硝酸盐残留检测面临的基质干扰和传统方法（如Griess法和反相色谱）准确性不足的问题，开发了一种基于尺寸排阻色谱（SEC）的新方法。该方法无需有机溶剂，有效分离亚硝酸盐和磷酸盐，显著提升分析准确性，并应用于模型香肠系统评估亚硝酸盐对pH、脂质氧化和颜色的影响。研究发现，亚硝酸盐浓度超过100 mg/kg未带来额外功能益处，残留亚硝酸盐在储存期间保持稳定，为优化肉制品中亚硝酸盐使用限量和保障消费者安全提供了重要依据。

　　

亚硝酸盐（NaNO₂）作为加工肉制品中广泛使用的添加剂，能够增强腌肉色泽、抑制氧化和微生物生长，并改善风味与质地。然而，亚硝酸盐在体内可转化为一氧化氮（NO），进而形成潜在致癌物亚硝胺，与高铁血红蛋白血症、糖尿病、甲状腺疾病及癌症风险相关。因此，准确监测肉制品中的亚硝酸盐残留对保障消费者健康至关重要。目前，常用的亚硝酸盐检测方法包括Griess比色法和反相高效液相色谱（HPLC），但这些方法存在明显局限性。Griess法通过量化NO间接估算亚硝酸盐含量，易受基质干扰（如肉制品中天然存在的NO或制备过程中亚硝基肌红蛋白的释放），导致准确性不足。反相色谱虽能分离化合物，但常用有机溶剂作为流动相，反而增加基质干扰，且无法有效区分亚硝酸盐与常见添加剂（如磷酸盐）的重叠峰，造成定量误差。此外，肉制品中复杂基质和多种添加剂（如盐、糖、磷酸盐）的干扰尚未得到系统研究，亟需开发更精确、稳定的分析方法。

为解决上述问题，本研究开发了一种基于尺寸排阻色谱（SEC）的新方法，旨在避免有机溶剂使用、减少基质干扰，并实现亚硝酸盐与磷酸盐的有效分离。该方法不仅提升了分析准确性，还被应用于模型香肠系统，以评估亚硝酸盐残留对产品理化性质（如pH、脂质氧化和颜色）的影响，并为优化亚硝酸盐添加水平提供科学依据。相关研究成果发表于《LWT》期刊。

研究采用以下关键技术方法：

1. 1.

   色谱分析：使用尺寸排阻色谱（Shodex OHPAK SB 802 HQ柱）和反相色谱（Bischoff Pronto SIL C18-ace-EPS柱）进行对比，以紫外检测器（210 nm）监测亚硝酸盐和磷酸盐的分离效果。SEC流动相为0.1% NaCl水溶液，反相色谱流动相含5 mmol/L辛胺和10%甲醇。

2. 2.

   样品制备：以猪后腿肉为原料制备模型香肠，添加0、50、100和200 mg/kg亚硝酸盐，经混合、填充、蒸煮（95°C, 45分钟）和真空包装后，于4°C储存1、30、60和90天。样本队列来源于本地市场的三头猪（110 kg，6月龄），每批次独立制备。

3. 3.

   提取与检测：采用甲醇-水（1:1, v/v）提取残留亚硝酸盐，经固相萃取（C18柱）净化后，通过SEC和Griess法进行定量对比。

4. 4.

   理化指标分析：包括pH测定、脂质氧化（TBARS法）、颜色参数（CIE L, a, b*, 色度, 色调角）和近似成分（水分、蛋白质、脂肪、灰分）。

5. 5.

   方法验证：通过线性方程、检测限（LOD）、定量限（LOQ）、精密度（日内和日间RSD）和回收率（92-108%）评估SEC方法的可靠性。

3.1. 色谱柱选择

通过对比反相色谱和SEC，研究发现反相色谱中亚硝酸盐与磷酸盐保留时间重叠，导致无法准确定量（图2）。SEC基于分子大小差异（磷酸盐分子量367 g/mol，亚硝酸盐69 g/mol），成功分离两者（图3），且无需有机溶剂，减少了基质干扰。在210 nm波长下，SEC显示出高灵敏度，亚硝酸盐标准品与香肠样本的保留时间和光谱一致，验证了方法的定性能力（图1, 图4）。这表明SEC适用于复杂肉制品矩阵中亚硝酸盐的可靠检测。

3.2. 新HPLC方法与Griess法在香肠模型中的残留亚硝酸盐含量比较

新SEC方法测得的残留亚硝酸盐含量显著高于Griess法（图5），且随储存时间延长，差异加剧。SEC结果显示，亚硝酸盐含量在储存30天内增加，之后稳定；而Griess法显示持续下降。这种差异源于Griess法易受磷酸盐等添加剂干扰，抑制显色反应，导致低估亚硝酸盐水平。SEC通过物理分离避免了此类问题，提供了更准确和稳定的 quantification。

3.3. 新方法分析残留亚硝酸盐对冷藏香肠模型的影响

亚硝酸盐添加水平和储存时间对pH、TBARS和颜色参数有显著交互作用（表3）。pH在0 mg/kg组储存90天时显著下降（至5.69），而添加亚硝酸盐（≥50 mg/kg）的组别pH更稳定（约6.09-6.12）。脂质氧化（TBARS值）在0和50 mg/kg组随储存时间增加而上升，100和200 mg/kg组则显著抑制氧化，且两者效果相似。颜色方面，添加亚硝酸盐（≥50 mg/kg）的组别 redness（a值）更高，yellowness（b值）和色调角更低，表明色泽更稳定。尤其，100和200 mg/kg组在颜色维护上无显著差异，显示100 mg/kg已足够。机制上，亚硝酸盐的抗氧化作用通过中和自由基（如羟基、过氧基）实现，但超过100 mg/kg未带来额外益处，提示功能饱和。此外，尽管残留亚硝酸盐水平稳定，氧化过程仍在进行，表明其长期效能可能受限。

研究结论表明，SEC方法是一种可靠、准确的亚硝酸盐残留分析技术，克服了传统方法的局限性。在应用层面，亚硝酸盐添加水平在100 mg/kg时即可提供充分的功能性益处（抑制脂质氧化、维持颜色和pH稳定），更高浓度（如200 mg/kg）未显示额外优势。残留亚硝酸盐在储存期间保持稳定，但其功能效果随时间可能减弱， due to 氧化途径的演变（如金属催化或过氧化氢介导的反应）。这些发现对优化肉制品中亚硝酸盐的使用具有重要指导意义：一方面，支持将添加上限设定在100 mg/kg左右，以平衡技术效能和食品安全；另一方面，凸显了需进一步研究亚硝酸盐稳定性机制和长期储存中的行为，以 refine 监管指南。该研究不仅提升了分析化学在食品科学中的应用，还为全球范围内亚硝酸盐法规的协调提供了科学依据，最终促进加工肉制品的质量与消费者安全。