苦荞来源芸香糖苷酶的底物特异性与反应优化及其在乙基芸香糖苷生物合成中的应用研究

本研究针对苦荞中天然芸香糖苷酶（RHE）缺乏系统表征的问题，通过纯化RHE并优化其催化条件，揭示了其对3-O-芸香糖苷类黄酮的特异性识别机制，成功实现乙基芸香糖苷（ER）的高效合成，为功能性食品开发提供了新型生物催化剂和理论依据。

　　

苦荞（Fagopyrum tataricum）作为一种营养与药用价值俱佳的作物，富含黄酮苷类化合物，其中芦丁（rutin）含量尤为突出。这些黄酮苷可通过内源芸香糖苷酶（rutin-hydrolysing enzyme, RHE）转化为生物活性更强的苷元或衍生化合物，例如在乙醇存在下可生成乙基芸香糖苷（ethyl rutinoside, ER）。ER作为一种烷基糖苷，不仅具有抗菌、抗炎、表面活性等多种生物活性，还被报道可改善皮肤状态、抑制乙酰胆碱酯酶以及发挥抗癌作用，在食品和化妆品行业中应用前景广阔。然而，由于商业化RHE酶的缺乏，其催化特性和最适反应条件一直未得到系统研究，限制了ER的定向生产和应用。

为此，研究人员从苦荞麸皮中成功分离纯化出食品级RHE，并系统优化了ER合成的反应条件，探究了该酶的底物特异性及其在复杂食品基质中的应用潜力。该研究发表于《LWT》，为黄酮苷的生物修饰和ER的高效生产提供了重要理论依据和技术支持。

在研究过程中，作者采用多种关键技术方法：首先通过硫酸铵沉淀、Sephadex G-100凝胶过滤和DEAE-650M阴离子交换色谱从苦荞麸皮中纯化RHE；利用SDS–PAGE和HPLC评估酶纯度；通过紫外吸收和傅里叶变换红外光谱（FTIR）进行结构表征；采用酶动力学分析及Lineweaver–Burk作图计算米氏常数（K_m）和最大反应速率（V_max）；借助分子对接（AutoDock软件）模拟RHE与不同底物的结合模式；最后将RHE应用于不同苦荞组织（花、麸皮、叶、茎）提取物中催化ER生成，并结合UPLC–MS/MS进行定量分析。

3.1. Purification and structural characterisation of RHE

经多步纯化后，RHE得率为19.72%，比活性提高至1198.63 U/mg，纯化倍数为9.19。SDS–PAGE显示其分子量约为60 kDa，HPLC–UV谱图中出现单一峰，表明样品纯度较高。UV光谱在280 nm处有吸收峰，FTIR显示3430 cm^?1处O–H和N–H键振动，1080 cm^?1和860 cm^?1处分别为吡喃环醚键和β-糖苷键特征吸收，证实RHE为糖蛋白。

3.2. Effects of pH on ER production catalysed by RHE

RHE在pH 5.0时活性最高，强酸（pH < 2）或碱性（pH > 8）环境均导致酶活显著下降。pH稳定性试验表明，在pH 4–6范围内孵育1小时后，酶活仍保持75%以上。

3.3. Effects of temperature on ER production catalysed by RHE

最适反应温度为40°C，高于此温度酶活逐渐降低，80°C时仅存11.72%活性。热稳定性分析显示，50°C孵育4小时残留酶活为81.72%，而70°C时1小时内酶活几乎完全丧失。

3.4. Effects of ethanol concentration on ER production catalysed by RHE

乙醇浓度20%时酶活最高，浓度超过50%时活性急剧下降，60%–100%乙醇中几乎检测不到ER生成。

3.5. Effects of substrate-to-enzyme ratio on ER production catalysed by RHE

底物酶质量比低于6时转化率最高，超过6后因底物沉淀及酶饱和效应导致转化率下降。

3.6. Investigation of RHE substrate specificity and ER transformation pattern

在8种黄酮苷中，RHE仅对具3-O-芸香糖基结构的化合物（芦丁、山奈酚芸香糖苷、花青素芸香糖苷、飞燕草素芸香糖苷）表现出催化活性，而对柚皮苷、橙皮苷、同根栀子苷和异槲皮苷无活性。动力学参数显示，RHE对芦丁和山奈酚芸香糖苷的催化效率（V_max/K_m）最高，而对两种花色素苷催化效率显著较低。

3.7. Molecular docking between RHE and 3-O-RutFlas

分子对接结果表明，芦丁与RHE结合能最低（-12.26 kcal/mol），其芳香环与TRP385和TYR343形成π–π堆积作用，而花色素苷类因缺乏此类相互作用导致结合亲和力较低。

3.8. Application of RHE to produce ER from complex food matrices

将RHE加入苦荞不同组织提取物中催化ER生成，花朵提取物中ER产量最高（93.77 μmol/L），其次为麸皮、叶和茎。含量分布热图显示花朵和麸皮中3-O-芸香糖苷类黄酮（3-O-RutFlas）含量最丰富，与ER产量正相关。

本研究首次系统阐明了苦荞R酶的最适催化条件与底物偏好性，证实其可高效催化3-O-芸香糖苷类黄酮转化为ER，拓展了RHE在功能性食品中的应用范围。分子对接从结构层面揭示了RHE与底物的相互作用机制，为酶工程改造提供了理论依据。此外，研究还发现RHE可作用于花色素苷类底物，尽管效率较低，但仍为开发富含ER的蓝色食品资源（如蓝莓、紫薯）提供了新思路。值得注意的是，ER本身抗氧化活性较低，其健康效益可能更多体现在其他生物活性方面，后续需通过细胞与动物实验进一步验证。综上所述，该研究不仅为苦荞资源的高值化利用提供了新技术，也为黄酮苷的生物转化与功能性食品开发奠定了坚实基础。