澳大利亚北部热带岩牡蛎细菌及弧菌群落多样性研究：食品安全与养殖健康的微生物基线评估

本研究针对热带岩牡蛎养殖中潜在病原弧菌风险，通过大范围采样和分子技术分析细菌及弧菌群落多样性，发现尽管多种人类致病弧菌（如V. parahaemolyticus、V. vulnificus）普遍存在，但毒力基因未检出，强调需以毒力而非丰度作为风险评估核心，为热带牡蛎产业食品安全与疾病防控提供关键依据。

　　

随着亚太地区热带岩牡蛎（Tropical Rock Oyster, TRO）养殖业的兴起，食品安全成为关键挑战，尤其是弧菌属（Vibrio）病原体带来的风险。弧菌是一类天然存在于温暖沿海和河口环境中的水生细菌，其中某些种类如副溶血性弧菌（V. parahaemolyticus）、创伤弧菌（V. vulnificus）、霍乱弧菌（V. cholerae）和溶藻弧菌（V. alginolyticus）可通过食用生海鲜引起人类肠胃疾病或通过接触海水导致感染。近年来，随着海水温度上升，这些病原体在温带牡蛎养殖区的影响日益显著，而热带地区由于常年高温，弧菌风险可能更为严峻。此外，弧菌还与太平洋牡蛎（Crassostrea gigas）夏季大规模死亡事件相关，如哈维弧菌（V. harveyi）、灿烂弧菌（V. splendidus）等。然而，对于澳大利亚北部新兴的黑唇岩牡蛎（Blacklip Rock Oyster, BRO）和“milky”牡蛎（Saccostrea mordax/lineage A）养殖，其细菌和弧菌群落的基线数据缺乏，阻碍了风险评估和行业健康发展。尤其考虑到该地区可能面临海洋热浪和热带风暴加剧的气候变化影响，理解牡蛎中微生物群落动态至关重要。

为此，研究人员在《Marine Environmental Research》上发表了一项研究，通过对澳大利亚北部3500公里海岸线上13个地点的野生和养殖热带岩牡蛎进行采样，综合运用高通量扩增子测序（16S rRNA和hsp60基因）、定量PCR（qPCR）和最大可能数-qPCR（MPN-qPCR）技术，分析了细菌和弧菌群落的多样性、丰度及潜在病原体分布。样本包括野生和养殖牡蛎，覆盖北领地、西澳大利亚和昆士兰州，采样时间跨越2019至2021年，考虑了干湿季差异。

主要技术方法包括：从牡蛎组织提取DNA后，使用Illumina NovaSeq平台进行16S rRNA基因V3-V4区和弧菌hsp60基因的扩增子测序，通过QIIME2和DADA2处理序列，并利用Silva和专用弧菌数据库进行物种注释；通过qPCR定量总细菌（16S rRNA基因）和总弧菌（弧菌特异性16S rRNA基因）丰度；采用MPN-qPCR方法检测副溶血性弧菌（靶向tlh基因）和创伤弧菌（靶向vvhA基因），并筛查毒力基因trh和tdh；使用PERMANOVA和多元统计模型分析群落差异。

研究结果如下：

3.1. 细菌多样性在牡蛎中的情况

细菌群落丰度在所有地点相似，但丰富度（ASV数量）差异显著，Maningrida最低，Croker Island最高。优势细菌家族为螺旋体科（Spirochaetaceae，21%）、支原体科（Mycoplasmataceae，20%）和弧菌科（Vibrionaceae，12%），支原体属（Mycoplasma）在75%以上样本中出现，表明其可能是牡蛎的核心共生菌。细菌群落组成因地点而异，但牡蛎种类（BRO与milky）或养殖与野生状态间无显著差异。养殖牡蛎在同一地点内相似度较高，而野生牡蛎更易变。

3.2. 人类和牡蛎的细菌病原体

16S rDNA序列中检测到潜在人类病原菌，如拟杆菌属（Bacteroides，最高63%）、弓形杆菌科（Arcobacteraceae，最高59%）、希瓦氏菌属（Shewanella）、不动杆菌属（Acinetobacter）和埃希氏菌-志贺氏菌属（Escherichia-Shigella，最高32%），但丰度普遍较低。已知与牡蛎疾病相关的菌属如玫瑰弧菌属（Roseovarius）也被检出，但丰度不高。弧菌属存在于所有样本中，相对丰度0.01-85%。

3.3. 弧菌群落特征

弧菌丰度在Goulburn Island最低，Milingimbi最高。野生BRO中弧菌16S rDNA拷贝数显著高于野生milky，但养殖与野生间无差异。通过hsp60测序鉴定出48个弧菌物种，其中90%的群落由8个物种主导：副溶血性弧菌（17.7%）、哈维弧菌（9.6%）、恶魔弧菌（V. diabolicus，8.8%）、溶藻弧菌（7.1%）、地中海弧菌（V. mediterranei，6.4%）、坎氏弧菌（V. kanaloae，5.8%）、托兰弧菌（V. toranzoniae，5.7%）和欧文斯弧菌（V. owensii，3.3%）。弧菌群落组成因地点而异，但牡蛎种类或养殖状态无显著影响。Bowen的牡蛎弧菌群落独特，以坎氏弧菌、托兰弧菌和恶魔弧菌为主。弧菌丰富度中位值从Borroloola的2个ASV到Bowen的50个ASV，地点间差异大。

3.4. 人类和牡蛎的弧菌病原体

检测到潜在人类致病弧菌如副溶血性弧菌、创伤弧菌、溶藻弧菌、河流弧菌（V. fluvialis）、恶魔弧菌和古弧菌（V. antiquarius）。副溶血性弧菌最普遍（97个样本，丰度2.2%-100%），野生BRO中相对丰度略高于养殖。潜在牡蛎病原体包括哈维弧菌、溶藻弧菌、灿烂弧菌、塔氏弧菌（V. tubiashii）、巴西弧菌（V. brasiliensis）等，其中哈维弧菌和溶藻弧菌最丰富。

3.5. 通过MPN-qPCR枚举副溶血性弧菌和创伤弧菌及毒力基因检测

78个样本中，77%检出副溶血性弧菌（浓度3.6->1100 MPN/g），63%样本<100 MPN/g；32%检出创伤弧菌，多数<3.0 MPN/g。37%牡蛎样本中副溶血性弧菌水平超过食品安全指南（>100 MPN/g），但所有样本均未检出毒力基因trh或tdh。

研究结论与讨论强调，尽管热带岩牡蛎中普遍存在食物安全相关弧菌物种（如副溶血性弧菌和创伤弧菌），但毒力基因缺失，表明当前基于物种丰度的风险评估可能高估实际风险，应转向以毒力为核心。弧菌群落多样性高，反映了热带环境的生物热点特征，且牡蛎作为滤食动物易积累多种弧菌。核心细菌如支原体和螺旋体可能扮演共生角色，而弓形杆菌科等人类病原菌需在采后管理中关注。该研究为热带牡蛎产业提供了微生物基线数据，支持食品安全决策，并指出未来需开展季节动态研究以识别高风险期。此外，恶魔弧菌的丰度和潜在致病性提示需重新评估其风险。总体而言，这项研究填补了热带牡蛎微生物生态的知识空白，对保障养殖安全和人类健康具有重要意义。