乙醇联合密封处理提升醉枣风味与抗氧化特性的生理及代谢组学机制研究

本研究针对鲜枣易腐烂、品质劣变快的产业难题，系统探讨了传统醉枣加工中乙醇浸泡与密封贮藏的协同保鲜机制。通过生理生化分析与非靶向代谢组学技术，发现40%乙醇处理结合7天密封可显著提升可溶性固形物（19.4 °Brix）、酯类含量（185.3 mg kg-1 DW）及抗氧化活性（SOD+52.8%），并鉴定出288种差异代谢物，涉及类黄酮生物合成与抗坏血酸代谢等关键通路。该研究为醉枣工业化生产提供了理论依据和技术支撑。

　　

鲜枣（Ziziphus jujuba）作为一种营养丰富且具有药用价值的水果，在中国有着悠久的食用历史。它富含碳水化合物、维生素C、矿物质、纤维以及多糖和类黄酮等生物活性化合物，具有增强免疫功能的功效。然而，鲜枣在室温下极易腐败，约一周内就会出现霉变、水分流失、变色和软化等问题。呼吸作用产生的活性氧（ROS）会消耗抗氧化剂，加速衰老过程。因此，开发有效的采后保鲜技术对于维持枣的品质和营养价值至关重要。

在此背景下，乙醇处理作为一种有前景的保鲜策略引起了研究人员的关注。研究表明，乙醇处理单独使用或与密封结合，能够延缓果蔬衰老、增强抗氧化能力并抑制微生物生长。低浓度乙醇蒸气（<10%）常用于调节成熟/发酵过程，而高浓度乙醇（>30%）则主要用于葡萄和鲜切茄子的抗菌作用。然而，大多数研究集中于乙醇蒸气或浸泡处理，对于直接使用高浓度乙醇并结合气密密封以增强营养价值的研究十分有限。传统的“醉枣”加工方法正是采用了这种策略：将鲜枣短暂浸泡于40-50%的白酒中，沥干后密封，在冷藏条件下可保存超过6个月，并在数周内形成浓郁风味。尽管这种方法应用普遍，但其作用机制仍不明确。

为了填补这一研究空白，本研究首次对醉枣这一传统食品进行了系统研究。研究人员假设其独特的非发酵性保鲜、浓郁香气和潜在的抗氧化物质积累源于乙醇-密封处理诱导的生理变化。本研究旨在表征其基本特征（香气、贮藏性、营养），并探索其初步的生理机制，特别是延长货架期和增强抗氧化能力方面。研究人员采用了非靶向代谢组学作为辅助方法，以鉴定与这些特性相关的关键代谢物和通路，从而揭示其独特性的生理基础。

主要技术方法

本研究以‘冬枣’为材料，设置了不同乙醇浓度（0%-80%）浸泡30分钟后沥干密封贮藏（0-14天）的实验组。通过感官评价、理化指标（可溶性固形物SSC、可滴定酸TA、酯类、乙醇、乙醛含量）测定以及抗氧化指标（维生素C、总酚、DPPH、FRAP、SOD、CAT活性、TBARS）分析评估处理效果。关键部分采用非靶向LC-MS/MS代谢组学技术（基于UHPLC-Q-TOF MS平台），通过XCMS进行数据预处理，利用PCA和OPLS-DA等多变量统计方法分析差异代谢物，并进行了KEGG通路富集分析。所有数据均采用SPSS进行方差分析（ANOVA）和Duncan多重比较检验。

研究结果

3.1. 乙醇和密封对枣风味属性的影响

经40%乙醇+密封（组合处理）处理的醉枣表现出最高的整体风味和最佳表型（最小皱缩，颜色/形态稳定）。到第14天，组合处理保留了显著更高的可溶性固形物（SSC: 19.4 °Brix，比对照12.5 °Brix高55.2%）和可滴定酸度（TA: 1.08 g kg^-1 DW，比对照0.64 g kg^-1 DW高68.8%）。乙醇处理（单独乙醇、组合）在第7天诱导酯类显著增加。虽然酯类水平在第14天下降，但组合处理仍保持最高（185.3 mg kg^-1 DW，比对照86.2 mg kg^-1 DW高114.9%）；单独密封显著降低了酯类。组合处理积累了最多的乙醇（56.8 mg kg^-1 DW，比对照高1208.8%）和乙醛（78.9 mg kg^-1 DW，比对照12.6 mg kg^-1 DW高526.2%）。

3.2. 乙醇和密封对枣衰老特性的影响

初始硬度（105–108 N）和TBARS水平（43–45 μmol kg^-1 DW）在各组间相似。到第7天，对照果实显示出显著软化（77 N，损失28.7%）和TBARS激增（189 μmol kg^-1 DW，增加320%）。密封保持了最高的硬度（102 N，损失5.6%）和最低的氧化程度（68 μmol kg^-1 DW），而组合处理表现出中间值。到第14天，对照硬度（38 N，损失64.8%）和TBARS（375 μmol kg^-1 DW，增加733%）严重恶化，而密封和乙醇处理减轻了这些影响。对照的重量损失（47%）超过密封（10%）和组合（38%），但低于单独乙醇（68%）。对照的腐烂率（93%）远超所有处理，组合处理显示出完全抑制（0%腐烂）。密封和单独乙醇减少了腐烂，但组合处理在抑制软化、脱水、氧化和腐烂方面提供了最强的保护。

3.3. 乙醇和密封对枣抗氧化特性的影响

初始抗坏血酸（AA）水平为2.6-2.8 g kg^-1 FW。到第14天，对照AA降至0.2 g kg^-1 FW，而组合处理显示出更好的保留（1.1 g kg^-1 FW）。值得注意的是，组合处理在第7天表现出大量保留（1.9 g kg^-1 FW）。对于总酚含量（TPC），初始水平在各处理间相似（约6.2–6.4 g kg^-1 DW）。观察到随时间推移总体下降趋势。到第14天，对照显著下降至2.1 g kg^-1 DW。单独乙醇处理导致略高但显著的保留（2.9 g kg^-1 DW）。值得注意的是，密封处理很大程度上保留了酚类含量，在第14天保持5.5 g kg^-1 DW。组合处理达到3.5 g kg^-1 DW。在DPPH测定中，组合处理在第14天显示出44%抑制率，显著高于对照（25%）和乙醇（34%），但低于密封（82%）。重要的是，组合处理在第7天相对于乙醇表现出短暂优势（68% vs 65%）。铁还原抗氧化能力（FRAP）显示组合处理（5.3 mmol kg^-1 DW）显著超过对照（3.2 mmol kg^-1 DW）。最引人注目的是，组合处理显示出 exceptional 的酶活性。SOD活性在组合处理中于第7天达到峰值（35.3 U mg^-1 protein），比对照高43.5%。类似地，CAT活性在组合处理中于第7天达到最大值（23.7 μmol min^-1 mg^-1 protein），比对照高32.4%。虽然密封显示出更好的长期保留，但组合处理在两种酶活性的早期阶段始终表现出优异性能。

3.4. 代谢物谱的质量控制和多变量分析及3.5. 醉枣中的关键差异代谢物

非靶向LC-MS/MS代谢组学在正负离子模式下检测到19292个特征。数据质量高，QC在PCA中紧密聚类，中位RSD < 30%。PCA显示乙醇密封处理组（ZuizaoA）与未处理枣（ZuizaoB）之间存在明显分离。监督式PLS-DA/OPLS-DA模型改善了区分度。OPLS-DA表现出强大的有效性（R²Y > 0.999, Q² > 0.992），并通过置换测试得到支持。在1416种代谢物中，352种是差异代谢物（|FC| ≥ 1.5, p ≤ 0.05）。VIP ≥ 1过滤鉴定出288种高置信度代谢物，包括192种上调和96种下调的代谢物。这些代谢物涵盖主要类别：脂质/类脂分子（109种化合物）显示甘油磷脂广泛下调但脂肪酸强烈上调；有机酸/衍生物（72种化合物）以氨基酸和二肽的 dramatic 积累为特征；苯丙素类（28种化合物）显著富集，特别是类黄酮如柚皮素和根皮苷；核苷酸/衍生物（18种化合物）包括嘌呤升高但腺苷减少；有机氧化合物（16种化合物）如甘油磷酸胆碱显著减少。关键功能转变包括：抗氧化剂（柚皮素、根皮苷；大黄酚FC=102.1）、风味增强代谢物（苯乙醛FC=5.7；谷氨酸FC=3.1；D-(-)-塔格糖FC=9.4）和抗菌剂（4-羟基香豆素FC=6.3；大黄酚）的非凡积累。氮代谢中间体（酮亮氨酸FC=26.2）和抗氧化剂（L-抗坏血酸FC=23.3）协同升高。

3.6. 醉枣中的整合代谢重编程

乙醇结合密封处理触发了枣中显著的代谢重编程， evidenced by 33条通路的富集（p < 0.05）和288种差异代谢物的鉴定。深刻的改变发生在中心碳和能量代谢中，突出表现为代谢通路（ko01100）的显著富集以及碳代谢（ko01200）、TCA循环（ko00020）、丙酮酸代谢（ko00620）和磷酸戊糖途径（ko00030）的显著变化。氨基酸代谢受到广泛影响，包括氨基酸生物合成（ko01230）、甘氨酸/丝氨酸/苏氨酸代谢（ko00260）、缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸生物合成（ko00290）和降解（ko00280）、精氨酸/脯氨酸代谢（ko00330）以及丙氨酸/天冬氨酸/谷氨酸代谢（ko00250）通路的显著变化。脂质代谢通路也观察到显著变化：不饱和脂肪酸生物合成（ko01040）、角质/木栓质/蜡质生物合成（ko00073）和脂肪酸生物合成（ko00061）。此外，次级代谢通路显著富集，包括次级代谢物生物合成（ko01110）、类黄酮生物合成（ko00941）和类黄酮降解（ko00946）。其他表现出显著改变的关键通路包括ABC转运蛋白（ko02010）、抗坏血酸/醛糖酸代谢（ko00053）、谷胱甘肽代谢（ko00480）、核苷酸代谢（ko01232）、嘌呤代谢（ko00230）、嘧啶代谢（ko00240）和磷脂酶D（PLD）信号通路（ko04072）。醉枣的独特品质源于协调的代谢变化。氨基酸代谢转变（Gly/Ser/Thr, Val/Leu/Ile）提升了风味化合物。糖代谢改变（半乳糖；淀粉/蔗糖）增强了甜味，而苯乙醛增强了花香。谷胱甘肽代谢（ko00480）维持了细胞氧化还原平衡。减少的磷脂和修饰的PLD信号表明膜稳定效应延迟了衰老。植物鞘氨醇积累增强了防御反应。类黄酮生物合成（ko00941） dramatically 增加了关键化合物：柚皮素、根皮苷和柚皮素-7-O-葡萄糖苷。与升高的维生素C和谷胱甘肽代谢物相结合，这显著提高了抗氧化能力，改善了营养价值和抗逆性。

结论与意义

本研究首次系统地证实了传统醉枣加工方法——40%乙醇浸泡结合密封贮藏——在提升枣果风味、延缓衰老以及增强抗氧化能力方面的科学价值。该联合处理通过协同作用，显著提高了可溶性固形物、酯类含量和关键风味物质（如苯乙醛），同时有效抑制了腐烂、减轻了氧化损伤。代谢组学分析揭示了其深层机制涉及广泛的代谢重编程，包括氨基酸、脂质、类黄酮等代谢通路的显著变化，特别是抗坏血酸/谷胱甘肽代谢和苯丙烷类生物合成通路的上调。这些代谢变化共同贡献于醉枣独特的风味形成、优异的保鲜效果和增强的营养品质。

该研究的意义在于为传统食品加工技术提供了现代科学阐释，揭示了乙醇与密封协同作用的生理和代谢基础，为醉枣的工业化标准化生产提供了理论依据和技术参数。同时，该研究策略也为其他果蔬的采后保鲜和风味改良提供了可借鉴的新思路。未来研究需进一步阐明风味形成的酶学机制，通过多组学技术验证代谢通路的调控网络，并优化工艺以减少乙醇和乙醛残留，确保产品的广泛食用安全性。