真菌芳香异戊烯基转移酶RePT对多样化吲哚衍生物的异戊烯化修饰及其卤素导向的区域选择性调控

本研究针对天然活性吲哚生物碱结构多样性不足的问题，通过真菌芳香异戊烯基转移酶RePT对23种吲哚衍生物进行酶法修饰。研究发现RePT可高效催化氟化色氨酸的C7位正向异戊烯化和N1位反向异戊烯化，首次揭示卤素取代基通过邻/对位导向效应调控DMATS家族酶区域选择性的新机制，为定向合成生物活性异戊烯化化合物提供了新策略。

　　

在天然产物化学领域，吲哚生物碱一直占据着重要地位，这些来自真菌和植物的分子宝库中蕴藏着众多具有药用价值的化合物。从治疗帕金森病的麦角碱到抗菌的色氨酸衍生物，这些活性分子往往带有一个共同的结构特征——异戊烯基团。这种由5个碳原子组成的异戊烯基单元如同给分子安装了一个"生物导航器"，不仅能增强化合物的脂溶性，提高其穿越细胞膜的能力，还能通过增加疏水性来提升与生物膜的亲和力，从而显著增强抗菌等生物活性。

然而，天然存在的异戊烯化吲哚化合物种类有限，如何高效、定向地合成结构多样的异戊烯化吲哚衍生物成为研究人员面临的重要挑战。传统的化学合成方法往往步骤繁琐、区域选择性差，且不够环保。自然界中的二甲基烯丙基色氨酸合酶（DMATSs）虽然能够催化异戊烯化反应，但大多数已知的DMATSs底物谱狭窄，区域选择性固定，难以满足多样化合成需求。

正是在这样的研究背景下，来自荷兰瓦赫宁根大学的研究团队将目光投向了来自Rasamsonia emersonii真菌的芳香异戊烯基转移酶RePT。这种酶此前已被证明能够对L-色氨酸进行C7和N1位异戊烯化，并对L-酪氨酸和酚类芪类化合物进行O-异戊烯化。但是，RePT是否能够接受更多样化的吲哚衍生物作为底物，其区域选择性是否可以通过底物修饰进行调控，这些问题仍有待探索。

为了解决这些问题，研究人员在《New Biotechnology》上发表了他们的最新研究成果。他们特别关注卤代色氨酸的异戊烯化，因为卤化不仅能够增强药物的药理特性，还能引入反应性基团用于后续的合成步骤。例如，抗生素krisynomycin中吲哚部分的氯化显著增强了其抗菌和抗生素增效活性。

研究团队采用了多种关键技术方法：通过基因重组技术在E. coli中表达并纯化带有His₆-SUMO标签的RePT蛋白；建立UHPLC-PDA-ESI-MSⁿ分析平台对23种吲哚底物的转化率和产物谱进行系统筛选；使用Orbitrap高分辨质谱进行精确质量分析；通过600/700 MHz核磁共振谱仪（包括¹H、¹³C、HMBC、HSQC和COSY等技术）对关键异戊烯化产物进行结构解析；通过固相萃取等技术进行毫克级制备以获得足量样品进行结构鉴定。

3.1. 异戊烯化产物的表征

研究人员通过UHPLC-PDA-ESI-MSⁿ分析建立了基于ESI-MS²谱图的决策指南，成功鉴定了大多数异戊烯化产物的类型（C-、O-或N-异戊烯化）。通过NMR技术对 selected化合物进行了详细结构解析，包括氟代L-色氨酸的异戊烯化产物（7a、7b、8a、9b）、吲哚-3-乙酸的异戊烯化产物（17d、17e）、吲哚-3-丙酸的异戊烯化产物（18c）以及（二）异戊烯化吲哚（23a、23c、23d），并通过高分辨质谱验证了分子式。

3.2. RePT对吲哚衍生物转化的一般观察

研究发现RePT强烈偏好L-构型色氨酸，对L-色氨酸(1)的转化率达到100%，而对其D-对映体(2)的转化率仅为20.8%。RePT能够灵活接受C4-C7取代的L-色氨酸(3-15)，其中氟化衍生物的转化率最高(>75%)。吲哚N1位的甲基化导致转化率几乎完全丧失。将色氨酸C3位的脂肪族骨架替换为不同基团(16-23)对转化率的影响各异，但多数降低至50%以下。

3.3. 色氨酸N1甲基化对RePT异戊烯化的影响

N1-甲基化L-色氨酸(3)几乎不被RePT异戊烯化(<4.0%)，这表明吡咯环上的NH在DMATS的异戊烯化机制中起着至关重要的作用，通过与活性位点中严格保守的谷氨酸羧基形成氢键，增加吲哚环的反应性，促进异戊烯化，并帮助稳定芳炔中间体。

3.4. L-色氨酸不同C5取代基对RePT异戊烯化（区域选择性）的影响

5-氟-L-色氨酸(8)与L-色氨酸(1)一样被完全转化(100±0.0%)。其他C5取代L-色氨酸的转化程度顺序为：甲基-(68.8±0.3%)、羟基-(51.8±0.1%)、氯-(24.8±0.3%)、甲氧基-(14.2±2.0%)和溴代-L-色氨酸(12.4±0.2%)。氟取代对RePT底物转化的影响最小，这可能与其介导电子给体特性有关。除了电子特性外， steric约束也在RePT底物转化程度中发挥作用。

3.5. 苯环不同位置卤化引导RePT异戊烯化的区域选择性

研究发现RePT还能催化C4、C6和C7卤代L-色氨酸(7,9-11,13,14)的异戊烯化，氟代色氨酸的转化率高于相应的氯代色氨酸。C5位卤化对RePT活性的影响比其他位置更大。值得注意的是，区域选择性随卤化位置的不同而强烈变化。C5-氟化使RePT的区域选择性转向N1-异戊烯化，而C4-和C6-氟化(7和9)则产生通常的C7-异戊烯化。C6-卤化几乎完全驱动反应朝向C-异戊烯化。

3.6. 吡咯环C3有不同取代基的吲哚的异戊烯化

研究发现，缺乏α-氨基基团(17和18)的芳香化合物仍能被RePT转化，尽管程度降低(约40%)。缺乏羧基基团导致转化率甚至更低(19和20)。α-羧基过于靠近吡咯环会显著阻碍RePT的催化作用，16几乎不被RePT异戊烯化。含硫化合物brassinin(21)转化良好，而带有噻唑取代基的camalexin(22)转化较差。吲哚(23)的转化率高达75.2%，主要发生C3-异戊烯化(23a)。

研究结论表明，RePT能够催化多种结构多样的吲哚衍生物的异戊烯化，能够生产C-和N-异戊烯化吲哚和色氨酸衍生物。特别值得注意的是，卤素等取代基可用于引导异戊烯化位置，通过RePT的双重区域选择性实现对C7或N1位异戊烯化的选择性控制。此外，RePT对多种氟化和氯化色氨酸的高转化率为创建多样化（反应性）产品开辟了可能性，这些产品可作为新型药物开发的先导化合物，或作为生物活性化合物生物催化合成的中间体构建块。

这项研究的重要意义在于首次证明了卤素取代基能够通过其特有的邻/对位导向效应调控DMATS家族酶的区域选择性，这为理性设计酶催化反应提供了新思路。通过结合合理的酶设计和有意选择的取代底物，有望实现对DMATS区域选择性的精细调控，为天然产物衍生化和药物发现提供了强大的工具。RePT对多样化底物的接受能力和可调控的区域选择性使其成为合成生物学和绿色化学应用中一个有前景的生物催化剂。