通过纤维蛋白网络 destabilization 实现选择性溶栓：肝素类似物 octaparin 的新机制

为解决临床溶栓药物因系统性纤溶酶原激活导致高出血风险的问题，研究人员开展了一项关于合成肝素类似物 octaparin 的研究，发现其通过直接结合纤维蛋白单体、改变其二級构象以抑制聚合并 destabilize 已形成的血栓，同时保留组织因子驱动的凝血过程，在体内外均表现出强效抗凝和溶栓活性且出血风险低，为血栓性疾病的治疗提供了新策略。

　　

血栓性疾病，尤其是静脉血栓栓塞（VTE），包括深静脉血栓（DVT）和肺栓塞（PE），是全球第三大常见心血管综合征，构成了重大的健康负担。随着人口老龄化和合并症的增加，其死亡率进一步加剧。每年，VTE影响每1000人中的0.75至2.69人，而在70岁及以上人群中，这一数字上升到2.0至7.0，凸显了年龄作为一个显著风险因素。除了急性死亡率，VTE还带来严重的长期后果。大约32%的幸存者在十年内经历复发，并且血栓后综合征的发展，加上巨大的医疗成本，对全球卫生系统构成了持续挑战。PE被认为是VTE最灾难性的结果之一，死亡率从1%到60%不等，然而，它仍然是院内死亡的主要可预防原因。这些数据强调了对治疗策略的迫切需求，这些策略不仅要预防血栓形成，还要有效溶解现有血栓而不增加出血风险。

纤维蛋白是静脉血栓的结构支架，在VTE的发病机制中起着核心作用。在凝血酶（Thrombin）的催化作用下，纤维蛋白原（Fibrinogen）转化为交联的纤维蛋白（Fibrin）网络，捕获红细胞，从而稳定血栓结构。因此，靶向纤维蛋白代表了一种关键的治疗策略——抑制其可以限制血栓扩展，而其降解则有助于恢复血管通畅。目前的抗凝剂，如肝素（Heparin）和磺达肝癸钠（Fondaparinux），靶向上游凝血因子（例如FXa），但不直接干扰纤维蛋白在维持血栓稳定性中的结构作用。虽然能有效减少血栓扩展，但这些抗凝剂与出血风险相关，需要肠胃外给药，并且在肾功能不全的个体中表现出局限性。此外，它们缺乏内在的溶栓活性，因此无法溶解已形成的血栓。尽管溶栓剂可以溶解血栓，但由于 catastrophic bleeding（特别是颅内出血）的风险，它们的使用仅限于高风险肺栓塞。这种疗效与安全性之间的治疗差距，推动了对能够同时抑制纤维蛋白形成和促进血栓溶解而不损害止血的药物的寻找。

虽然肝素类似物是已确立的抗凝剂，但没有一种表现出直接的溶栓活性。先前，研究人员将合成的八糖肝素（octaparin）表征为一种抗凝剂，可增强AT-III介导的FXa抑制。octaparin是一种硫酸化的八糖，使用riclinoctaose作为起始材料通过一锅硫酸化反应合成。其结构通过傅里叶变换红外光谱（FTIR）、一维和二维核磁共振（¹H NMR和¹³C NMR）光谱进行了表征。结果证实octaparin具有明确的链长和特定的硫酸化修饰位点，分子量为2,968 g/mol。本研究报道了octaparin作为一种直接的纤维蛋白靶向溶栓剂，通过一个先前未被认识的机制发挥作用，并假设它可以在不损害止血的情况下实现有效的溶栓，这是一个具有重大治疗意义的意外发现。

为了开展这项研究，研究人员运用了多种关键技术方法。研究使用了小鼠肺栓塞模型和下腔静脉（IVC）血栓形成模型进行体内药效评价。通过全血凝固时间（WBCT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶时间（TT）等体外凝血实验评估抗凝活性。采用荧光显微镜和扫描电子显微镜（SEM）观察纤维蛋白网络结构。通过分子对接（Molecular Docking）、微量热泳动（MST）、紫外-可见吸收光谱和荧光光谱分析了octaparin与纤维蛋白原/纤维蛋白单体的相互作用。傅里叶变换红外光谱（FTIR）用于分析纤维蛋白单体二级结构的变化。此外，还进行了血小板活化和聚集实验、体外溶栓实验以及药代动力学和毒理学研究。人源血液样本来自健康捐献者。

3.1. Effective anticoagulation with minimal bleeding risk despite weak FXa inhibition by the heparin analogue octaparin

研究结果表明，octaparin在小鼠全血凝固实验中显著延长了凝血时间，其抗凝效果与依诺肝素（Enoxaparin）相当，优于磺达肝癸钠。在小鼠皮肤出血和脑出血模型中，肝素和依诺肝素均引起可见出血，而octaparin即使在500 mg/kg的高剂量下也未引起任何可观察到的出血。药效学分析显示，octaparin（40 mg/kg）静脉给药后10分钟内达到峰值血浆抗凝活性。进一步的动力学分析显示，octaparin对凝血因子FXa的抑制活性相对较弱，在0.05 mg/mL浓度下抑制率仅为18.5%，并且对因子FIIa没有抑制活性。这些结果表明，octaparin可能通过不同于传统肝素类药物的机制发挥其抗凝作用，从而提供了良好的效险平衡。

3.2. Selectively depolymerizes fibrin-containing clots by uniquely inhibiting fibrin network assembly

纤维蛋白形成实验表明，octaparin在1 mg/mL时几乎完全抑制纤维蛋白网络组装，而肝素、依诺肝素和磺达肝癸钠即使在更高浓度下也无法阻止浊度形成。荧光显微镜显示octaparin处理下的纤维蛋白网络呈现多孔结构。纤维蛋白形成动力学结果表明，octaparin以浓度依赖的方式显著减少了最大纤维蛋白形成量。流变学分析表明，在凝血酶诱导的纤维蛋白原转化为纤维蛋白凝胶的过程中，octaparin显著降低了储能模量（G'）和损耗模量（G''），同时显著增加了相位角（δ），在1 mg/mL浓度下相位角接近90°，表明呈液体样状态。octaparin还以剂量依赖的方式抑制了红细胞-纤维蛋白复合血栓的形成，并显著 destabilize 了这些血栓。体外溶栓实验表明，octaparin（1 mg/mL）几乎完全降解了纤维蛋白血栓和红细胞-纤维蛋白复合血栓，而链激酶（Streptokinase）没有显示出纤溶效果。扫描电镜（SEM）分析显示，随着octaparin浓度的增加，纤维蛋白网络间隙逐渐变宽，表明血栓的结构 destabilization。

3.3. Prevents thrombin-induced pulmonary embolism

在小鼠 thrombin 诱导的急性肺栓塞模型中，thrombin攻击引发了未治疗（THR）小鼠的急性生理窘迫，表现为呼吸困难、抽搐和肢体瘫痪，最终在几分钟内导致100%死亡率。用低剂量octaparin（10 mg/kg）预处理将存活率提高到50%，而中剂量（30 mg/kg）和高剂量（40 mg/kg）进一步将存活率分别提高到80%和100%，同时显著减轻了不良症状。血液学参数，包括白细胞和红细胞计数、血红蛋白和血小板——被thrombin显著降低——被octaparin预处理剂量依赖性地恢复正常。H&E染色和纤维蛋白免疫荧光显示，THR小鼠肺部有广泛的血栓形成和血管周围纤维蛋白沉积，而octaparin以剂量响应的方式减轻了这些情况。Thrombin还引发了全身性炎症，升高了血清IL-6和TNF-α水平。octaparin剂量依赖性地抑制了这些细胞因子。肺组织qPCR分析表明，thrombin诱导了促炎介质（IL-6, TNF-α, CXCL1, CCL2）的上调，所有这些都被octaparin显著抑制。

3.4. Dissolves venous thrombosis in mice

在小鼠下腔静脉（IVC）血栓形成模型的治疗 protocol 中，血栓诱导24小时后给予octaparin。12小时后的多普勒成像显示，未经治疗的小鼠IVC完全闭塞（蓝色信号），而octaparin恢复了血流（红色信号），表明血栓溶解。一致地，与IVC组相比，octaparin治疗小鼠的血栓长度和重量均显著减少，证实了其溶解血栓的能力。组织学上，H&E染色证明对照组小鼠IVC几乎被有组织的血栓完全闭塞，而octaparin恢复了血管通畅并减少了管腔内血栓负荷。纤维蛋白免疫荧光进一步揭示了IVC组有明显的纤维蛋白沉积，而octaparin以剂量依赖的方式破坏了这种沉积。

3.5. Disrupt fibrin polymerization through direct structural interactions

分子对接模拟揭示了octaparin与纤维蛋白原之间的高亲和力结合，结合能为-8.6 kcal/mol。MST结果证实octaparin与纤维蛋白原具有高结合亲和力。紫外-可见光谱显示天然纤维蛋白原在280 nm处有最大吸收峰，随着octaparin浓度的增加，该吸收峰逐渐降低，表明octaparin与纤维蛋白原之间存在相互作用。荧光分析（激发280 nm，发射350 nm）显示，随着octaparin浓度的增加，纤维蛋白原的荧光强度降低，表明结合后荧光团微环境极性发生变化。SDS-PAGE分析证实，与octaparin结合的纤维蛋白原仍然容易被凝血酶介导的切割成纤维蛋白单体。值得注意的是，octaparin也直接结合纤维蛋白单体，这通过紫外吸收的类似减少和荧光猝灭得到证明。FTIR分析表明，octaparin诱导纤维蛋白单体发生构象重排。随着octaparin浓度的增加，纤维蛋白单体二级结构中的α-螺旋和β-折叠含量逐渐减少，而无规卷曲结构变得更加明显。这些二级结构元素对于通过分子间氢键和疏水相互作用稳定纤维蛋白聚合至关重要。向无序构象的转变很可能 destabilize 了纤维蛋白的聚合能力状态，从而损害凝块形成。

3.6. Anticoagulation and reduced HIT risk in human systems

在体外人类血浆系统中，octaparin比肝素类药物更强地延长了APTT，但不影响PT。octaparin剂量依赖性地抑制了人全血凝块收缩和凝血酶诱导的人血浆凝块收缩，同时显著降低了富血小板血浆再钙化过程中的储能模量和损耗模量。与人源纤维蛋白网络的体外实验表明，octaparin产生了明显的剂量依赖性破坏，表现为进行性解聚的特征。血小板实验表明，octaparin不诱导人血小板活化或聚集，表明HIT风险较低。研究发现，0.05 mg/mL的octaparin在体外可以被0.25 mg/mL的鱼精蛋白（Protamine）完全中和，表明鱼精蛋白可以有效逆转octaparin的抗凝活性。

研究结论和讨论部分强调，octaparin代表了一种新型的双重作用剂，它通过独特地靶向纤维蛋白聚合同时保留止血能力，从而弥补了治疗差距。与主要抑制FXa和FIIa等凝血因子的传统肝素类抗凝剂不同，octaparin部分通过干扰纤维蛋白形成来发挥其抗血栓作用。octaparin的溶栓机制不依赖于纤溶酶原激活，而是通过直接解聚成熟的纤维蛋白网络来溶解血栓，这代表了一种不同于传统酶促纤溶的新机制。octaparin的双靶点抗凝机制——抑制FXa和纤维蛋白单体聚合——解释了其功效和安全性。具体来说，octaparin优先延长内源性凝血时间，同时保留外源性途径，从而在血管损伤后保留止血功能。高剂量的octaparin对外源性途径活性影响极小，确保了伤口愈合所需的生理性纤维蛋白凝块形成。这种选择性阻止了病理性静脉血栓（内源性驱动）而不损害止血性凝块（外源性驱动），从而减轻了出血风险。其抗凝活性可以被鱼精蛋白逆转，这一特点是磺达肝癸钠和直接口服抗凝剂所不具备的，为临床医生提供了一种快速可控的解毒机制。由于其独特的机制和良好的安全性，octaparin有望成为治疗急性VTE管理（例如中危肺栓塞和IVC血栓形成）和高危人群（如肿瘤或术后患者）长期预防的多功能候选药物。选择性溶栓代表了一种新型的抗凝策略，通过精确靶向纤维蛋白来抑制血栓形成，同时保留生理性止血。通过平衡疗效和安全性，它在传统疗法因出血风险而受限的临床环境中具有巨大的治疗潜力。该研究发表在《Pharmacological Research》上。