双除草剂代谢酶协同作用赋予长芒苋非靶标抗性：谷胱甘肽代谢与氨基酸谱的生理学证据

本研究针对长芒苋(Amaranthus palmeri)对磺酰脲类除草剂产生非靶标抗性(NTSR)的机制难题，通过比较敏感(S)与抗性(R)种群在烟嘧磺隆(nicosulfuron)处理下的生理响应，首次在双子叶杂草中证实细胞色素P450单加氧酶(P450s)与谷胱甘肽S-转移酶(GSTs)的协同代谢作用，揭示了抗性种群通过维持ALS活性避免氨基酸代谢紊乱，并阐明了谷胱甘肽(GSH)代谢在抗氧化应激中的关键作用，为杂草抗性治理提供了新见解。

　　

在全球农业生产的挑战中，杂草对除草剂产生的抗性已成为一个日益严峻的问题。其中，乙酰乳酸合成酶（Acetolactate synthase, ALS）抑制剂类除草剂，因其高效性和广谱性而被广泛使用，但随之而来的是越来越多的杂草种群进化出抗性。抗性机制主要分为两类：靶标抗性（Target-site resistance, TSR）和非靶标抗性（Non-target site resistance, NTSR）。TSR源于ALS酶本身的基因突变，而NTSR则涉及除草剂的吸收、转运、尤其是代谢降解过程。尽管多数抗性种群属于TSR，但由代谢增强导致的NTSR因其复杂性及潜在的跨除草剂多抗性风险，引起了研究者更大的担忧。

长芒苋（Amaranthus palmeri）是一种极具侵略性的全球性恶性杂草，严重威胁玉米、棉花、大豆等作物生产。它已对包括ALS抑制剂在内的多种除草剂进化出抗性。以往研究证实，其TSR种群通过ALS基因突变逃避除草剂作用，并因此不表现出典型的ALS抑制剂引发的生理紊乱。然而，对于NTSR种群，其如何通过代谢机制抵抗除草剂，以及这一过程对植物生理状态（如氨基酸平衡和氧化应激响应）产生何种影响，此前在双子叶杂草中尚未有深入研究。

为了解答这些问题，一项发表在《Plant Science》上的研究对一个具有NTSR特性的长芒苋种群（R）进行了深入的生理学分析。研究人员通过水培实验，用ALS抑制剂烟嘧磺隆（nicosulfuron）单独或联合GST抑制剂NBD-Cl处理敏感（S）和抗性（R）种群，并在7天后检测了叶片中的游离氨基酸谱、谷胱甘肽（Glutathione, GSH）含量、GST活性及其基因表达。此外，他们还利用琼脂平板根长实验，在添加P450抑制剂马拉硫磷（malathion）或NBD-Cl的条件下，评估了除草剂的效应，以验证两种代谢酶在抗性中的作用。

本研究运用了几个关键的技术方法：采用水培体系培养敏感与抗性长芒苋种群并进行除草剂处理；利用毛细管电泳结合激光诱导荧光检测技术精确测定游离氨基酸谱及谷胱甘肽及其相关化合物（如GSSG、Cys、γ-GC）的含量；通过分光光度法测量以CDNB为底物的GST总酶活性；采用实时定量PCR（qRT-PCR）技术分析特定Phi类和Tau类GST基因的表达；并创新性地使用垂直琼脂平板培养系统，以根长抑制作为除草剂药效的生物学标志，在代谢抑制剂存在下进行验证。研究所用抗性种群材料源自美国堪萨斯州，通过筛选无ALS基因突变的个体杂交后代获得。

3.1. 氨基酸谱

研究人员发现，仅S种群在烟嘧磺隆处理后表现出典型的氨基酸谱变化：总游离氨基酸积累，支链氨基酸（BCAAs）比例下降，酸性氨基酸（Glu, Asp）减少而酰胺氨基酸（Gln, Asn）增加。这些变化是ALS抑制导致蛋白水解激活的已知后果。然而，R种群在除草剂处理下未出现任何显著变化，其反应与TSR种群相似。这表明，只要ALS活性得以维持（无论是通过酶突变还是除草剂代谢降解），由ALS抑制剂引发的氨基酸代谢紊乱就可以被避免。在根部，氨基酸谱对处理均不敏感。

3.2. 谷胱甘肽及相关化合物

谷胱甘肽代谢分析揭示了种群间的基础差异和胁迫响应。R种群叶片的基础GSH及其前体半胱氨酸（Cysteine, Cys）和γ-谷氨酰半胱氨酸（γ-glutamyl-cysteine, γ-GC）含量显著高于S种群，暗示其具有更强的先天抗氧化能力。在S种群中，烟嘧磺隆处理诱导了氧化应激，导致GSH、总谷胱甘肽及前体含量升高，这是一种保护性抗氧化反应。当联合使用GST抑制剂NBD-Cl时，这种积累效应更为显著，说明当GST的解毒功能被抑制时，植物需要合成更多的GSH来应对加剧的氧化压力。在R种群中，仅当烟嘧磺隆与NBD-Cl联合使用时，才观察到GSH和总谷胱甘肽的显著增加，这表明在GST功能受损的情况下，除草剂才能对R种群产生足够的氧化压力。

3.3. 谷胱甘肽-S-转移酶：活性与基因表达

酶活分析显示，R种群的叶片和根部的基础GST活性均显著高于S种群。烟嘧磺隆处理能诱导两个种群叶片GST活性的升高。这些结果强烈暗示GSTs参与了R种群的抗性机制。然而，尽管检测了三个Phi类（GSTF2.4, GSTF2.5, GSTF8）和三个Tau类（GSTU2, GSTU18, GSTU19）GST基因的表达，但未能发现任何一个基因的表达变化与酶活性的诱导明确相关。这表明可能还有其他特定的GST同工酶负责对烟嘧磺隆的代谢，其识别需要更深入的组学研究。

3.4. 垂直平板中的根生长

根长实验为代谢酶的协同作用提供了关键的整体生物学证据。在S种群中，烟嘧磺隆强烈抑制根生长，添加NBD-Cl或马拉硫磷（P450抑制剂）并不能逆转这种抑制。相反，在R种群中，烟嘧磺隆单独处理并不影响根生长，但当其与NBD-Cl或马拉硫磷中的任何一种抑制剂联合使用时，根生长均受到显著抑制。这一结果证明，无论是GSTs还是P450s的活性，对于R种群实现完整的抗性都是必需的，抑制其中任何一种都足以使除草剂恢复药效。

本研究得出结论，对磺酰脲类除草剂具有NTSR的长芒苋种群，通过P450s和GSTs的协同代谢作用，有效地降解了除草剂，从而维持了ALS酶的正常功能。这使得抗性植株成功避免了ALS抑制剂引发的典型生理紊乱，包括氨基酸代谢失衡和严重的氧化应激。特别重要的是，该研究首次在双子叶杂草中提供了GSTs参与磺酰脲类除草剂代谢的直接生理学证据，并揭示了其与P450s的互补作用机制。

该发现的科学意义重大。它强调了NTSR机制的复杂性，以及代谢酶介导的多抗性风险——同一个杂草种群可能通过相同的酶系统代谢不同作用机制的除草剂。从应用角度来看，理解这些协同代谢途径为设计新的除草剂增效剂（如GST或P450抑制剂）提供了潜在靶点，有助于克服现有的抗性问题，制定更可持续的杂草治理策略。未来研究需要利用转录组学等工具精确鉴定负责除草剂代谢的具体GST同工酶，从而为精准防控提供分子基础。