高效一体化单管磷酸化蛋白质组学工作流程的开发及其在高通量分析中的应用

本刊推荐：本研究创新性地开发了FEAS-phospho一体化工作流程，通过单管操作实现蛋白质提取、酶解和磷酸肽富集，将样品制备时间从传统方法的数十小时缩短至2.5小时。该方法采用100% TFA快速提取蛋白，结合Ti4+-IMAC微球进行SP3-like消化与磷酸肽富集，在DDA/DIA模式下分别鉴定到6247和8400+磷酸肽，为高通量磷酸化蛋白质组学研究提供了革命性解决方案。

　　

亮点

细胞培养与组织采集

MCF-7细胞在补充10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素（PS）的DMEM培养基中培养，于37℃、5%二氧化碳环境下孵育。细胞通过1200rpm离心5分钟收集，经冰预冷PBS溶液清洗三次后，将细胞沉淀保存于-80℃备用。本研究使用6周龄雄性C57BL/6小鼠。

TFA提取与SP3-like消化的优势

首先分别采用100% TFA和经典SDC缓冲液提取MCF-7细胞蛋白，随后进行溶液内胰酶消化。TFA裂解液在肽段和蛋白鉴定数量上呈现可比性结果。但TFA裂解液在消化前需用9倍体积的2M Tris-HCl缓冲液谨慎中和，导致产生大量浑浊溶液。为消除中和步骤，我们向TFA裂解液中添加SiO₂磁珠或Ti⁴⁺-IMAC微球进行SP3-like消化。

结论

为解决经典磷酸化蛋白质组样品制备流程繁琐、处理时间长、重复性低等挑战，我们开发了快速高效的一体化单管磷酸化蛋白质组样品制备方法（FEAS-phospho）。该方法利用100% TFA进行样品裂解，3分钟内完成蛋白提取且无需机械破碎或超声处理。通过Ti⁴⁺-IMAC微球对TFA裂解液进行SP3-like消化，有效消除了蛋白沉淀和中和步骤。