基于报告病毒微中和试验的人体临床试验流感特异性抗体评价方法的建立与标准化

本刊推荐：本研究遵循良好临床实验室规范（GCLP），首次对基于复制受限型报告病毒（R3ΔPB1）的微中和试验（RMN）进行了系统方法学验证。该技术通过荧光报告基因替代病毒PB1基因，可在生物安全二级（BSL-2）实验室安全开展流感中和抗体检测，与传统微中和（MN）试验呈现高度相关性（Spearman's r=0.84-0.98），为疫苗临床试验提供了标准化、高通量的中和抗体评价方案。

　　

Highlight

采用复制受限型报告病毒（其中必需病毒基因——聚合酶碱性1（PB1）基因被报告基因取代）是安全检测人血清对抗流感病毒的标准化方法。复制受限型报告病毒可在表达缺失病毒基因的特定细胞系中繁殖，这使其适用于生物安全二级（BSL-2）实验室。该方法需要经过验证才能用于人体临床试验的标准化检测。

Influenza strains

R3ΔPB1 A/New Caledonia/20/1999 (H1N1)、R3ΔPB1 A/California/07/2009 (H1N1)、R3ΔPB1 A/Singapore/INFIMIH-16-0019/2016 (H3N2) 和 R3ΔPB1 A/Texas/71/2017 (H3N2) 在表达PB1的MDCK-SIAT1细胞中繁殖，病毒生成方案先前已有描述 [9]。这些报告病毒是复制受限的，并非复制无能。它们需要在表达PB1基因的细胞系中繁殖和感染。该细胞系传代次数限制在20代以内以维持其特性。

Results

在进行实验之前，已预先制定并记录了包含验证参数、研究设计和接受标准的 assay qualification plan（方法验证计划）。针对A/New Caledonia/20/1999 (H1N1) RMN assay（报告病毒微中和试验）验证所测试的参数包括：系统适用性标准（SSC）、线性、精密度、准确度、范围、检测限（LOD）和定量限（LOQ）、特异性以及耐用性，所有这些都设有预定义的接受标准。

Discussion

在此，我们报告了首次对RMN assay（报告病毒微中和试验）进行验证，以量化株特异性抗体滴度。该试验的精密度、准确度、线性、范围、LOD、LOQ、耐用性和特异性均成功得到证实，确保了结果的可重复性和可靠性。针对H1N1和H3N2病毒，均证明了传统MN（微中和）试验与RMN Assay（报告病毒微中和试验）之间存在相关性。通过使用单克隆抗体（mAbs）和人类临床样本进行的测试表明，R3ΔPB1病毒保留了亲本野生型病毒的中和敏感性，其血凝素（HA）和神经氨酸酶（NA）相匹配。传统MN试验和RMN试验之间的高度相关性（Spearman's r = 0.84–0.98, p < 0.001）表明，RMN试验可以可靠地替代传统MN试验，用于检测针对同源和异源病毒的中和抗体。这种高通量检测方法将有助于确定保护性关联（correlates of protection），并为未来人体临床试验的荟萃分析（meta-analyses）做出贡献。

Conclusion

总之，我们成功验证了针对A/New Caledonia/20/1999 (H1N1)的RMN assay（报告病毒微中和试验）。该验证试验显示出可接受的精密度、准确度、线性、范围、LOD、LOQ、耐用性和特异性。RMN试验与传统的基于ELISA的MN试验高度相关。该试验将用于评估新型流感候选疫苗在人体临床试验中引发的中和抗体反应。