利用蝙蝠天然免疫因子tetherin实现重组MVA病毒的快速拯救与高效扩增

本文推荐研究人员针对痘病毒载体构建过程中重组病毒筛选效率低、耗时长的问题，开发了一种基于蝙蝠天然免疫因子tetherin的新型负向筛选系统。该研究证实吸血蝠tetherin(Dr)与果蝠tetherin(Ra)均能有效抑制亲代病毒复制，实现了双基因位点同步重组和无动物源成分悬浮培养体系中的快速病毒拯救，为个性化疫苗和抗疫药物研发提供了关键技术突破。

　　

在生物医药领域，痘病毒载体尤其是改良型安卡拉痘苗病毒（Modified Vaccinia Ankara, MVA）因其卓越的安全性和强大的外源基因携带能力，已成为预防性疫苗和肿瘤治疗性疫苗的重要平台。然而，传统的重组病毒构建方法依赖同源重组和反复的空斑纯化或有限稀释筛选，整个过程通常需要42-84天，且重组病毒在初代重组产物中占比仅约0.1%。这种低效耗时的方法严重制约了MVA载体在突发传染病防控和个性化肿瘤治疗中的应用。

为了解决这一技术瓶颈，来自德国ProBioGen AG的研究团队另辟蹊径，从蝙蝠强大的天然免疫系统中寻找灵感。蝙蝠作为多种病毒的自然宿主，其免疫系统具有独特且高效的病毒控制机制。其中，tetherin（也被称为BST-2）是一种晚期起效的天然免疫因子，通过其特殊的二聚体结构（两端分别具有跨膜结构域和GPI锚定域）将出芽的病毒颗粒"拴"在细胞膜上，从而抑制病毒释放。虽然痘病毒的形态发生主要在细胞质内完成，且成熟病毒粒子通过融合细胞膜释放时会丢弃最外层的膜，但研究人员意外发现，当tetherin由病毒自身表达时，能强烈抑制痘病毒的复制。

在这项发表于《Virology》的研究中，研究人员首先开发了基于埃及果蝠（Rousettus aegyptiacus, Ra）tetherin的筛选系统，并在此基础上进一步验证了普通吸血蝠（Desmodus rotundus, Dr）tetherin的同等有效性。这两种tetherin蛋白序列同源性仅51%，但都表现出强大的抗病毒活性。研究人员还构建了EGFP-Dr tetherin融合蛋白，发现其抗病毒活性有所减弱，这为调节选择强度提供了可能。

研究采用的关键技术方法包括：利用TetR可诱导表达系统控制tetherin表达；通过同源重组技术构建重组MVA病毒；采用PCR和限制性片段长度多态性（RFLP）分析验证基因型；建立稳定表达tetherin的细胞系；开发悬浮培养系统中的重组病毒拯救流程；使用荧光报告基因（mCherry、EGFP、mTagBFP2）跟踪重组过程。

3.1. 吸血蝠tetherin是高效的选择标记

研究人员通过微孔板感染实验证明，表达Dr tetherin的MVA病毒在加入多西环素诱导后完全不能复制，其效果与Ra tetherin相当。表达EGFP-Dr tetherin融合蛋白的病毒则显示出较弱的复制能力，表明N端融合EGFP会减弱tetherin的活性。

3.2. EGFP与Dr tetherin的融合

为探索tetherin的细胞内分布和功能机制，研究人员构建了C端和N端EGFP融合的tetherin蛋白。发现EGFP-Dr tetherin融合蛋白同时定位于质膜和细胞内斑点状结构（可能位于核周器）。稳定表达EGFP-Dr tetherin的细胞系能限制正常MVA的复制，但抑制程度不如病毒自身表达的tetherin强烈。

3.3. 与E3标记恢复阳性选择方法的比较

研究人员还开发了基于痘病毒防御蛋白E3的阳性选择系统作为对比。E3蛋白能结合并屏蔽dsRNA，同时与蛋白激酶R（PKR）相互作用抑制信号转导。虽然E3标记恢复也能促进重组病毒富集，但需要操作员辅助的有限稀释步骤，效率不如tetherin负向选择系统。

3.4. 构建CR19.Dr/Ra用于同步双位点替换

研究人员成功构建了同时携带Dr和Ra两种tetherin的MVA病毒（CR19.Dr/Ra），并实现了在两个远距离基因组位点（DS VI和TK locus）同步进行重组替换，获得同时表达EGFP和mCherry的双重组病毒。

3.5. 悬浮系统中的重组

最重要的是，研究人员开发了在化学成分确定的悬浮培养系统中进行重组病毒拯救和扩增的流程。整个过程仅需三个传代步骤（9天），无需操作员干预的空斑挑选或流式分选，最终可获得足够接种170升生物反应器的病毒产量。PCR和RFLP分析证实所有重组病毒均为预期基因型，无亲代病毒污染。

研究结论表明，tetherin筛选系统具有高度效率和通用性。两种亲缘关系较远的蝙蝠tetherin（Ra和Dr）都有效，提示tetherin的抗痘病毒活性可能源于其独特的蛋白质构型（平行或反平行同源二聚体，两端具有膜锚定域）而非免疫调节信号通路。病毒自身表达的tetherin比细胞组成型表达的tetherin具有更强的抗病毒活性，表明tetherin可能主要在病毒形态发生阶段 near viral factories 附近发挥作用。

这项研究的重要意义在于：首先，建立了高效、快速的痘病毒载体构建平台，大幅缩短了重组病毒制备时间；其次，实现了多位点同步重组，提高了载体构建效率；第三，开发了无动物源成分的悬浮培养系统，符合GMP生产要求；最后，为个性化肿瘤疫苗和突发传染病疫苗的快速开发提供了技术保障。这些突破对于推动痘病毒载体在精准医疗和公共卫生应急领域的应用具有重要价值。